水蛭酶解提取物對血管內(nèi)皮功能紊亂保護作用的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種發(fā)病率比較高的心血管疾病，其發(fā)病機制很復(fù)雜，目前認(rèn)為內(nèi)皮功能紊亂(endothelial dysfunction)是AS發(fā)病早期過程中的一個關(guān)鍵因素。內(nèi)皮功能紊亂是指血管內(nèi)皮細(xì)胞功能上的變化，主要特征表現(xiàn)為NO釋放量和生物利用度的降低，粘附兇子的表達增加和趨化因子的表達增加等。這種分子水平的變化與循環(huán)中的血細(xì)胞及血管中的平滑肌細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致血管功能及結(jié)構(gòu)上的變化，繼而引發(fā)了A

2、S。內(nèi)皮功能紊亂在AS的發(fā)病早期過程中起著至關(guān)重要的作用，改善內(nèi)皮功能紊亂將會減少AS的發(fā)病風(fēng)險。很多的研究證明通過改變生活方式和藥物治療等方法能夠改善內(nèi)皮功能，這些相互作用能夠降低AS的發(fā)病率，主要的采用的方法有抗氧化治療，降低血脂治療，改變生活方式等。
　　水蛭作為一味傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有抗凝血、抗血栓、保護細(xì)胞、抗炎以及抗腫瘤的作用，在臨床上被廣泛應(yīng)用于包括心血管疾病(如腦梗，心梗，AS)，高脂血癥，腎臟疾病，婦科及男科

3、疾病等。那么這些疾病是否有共同點來作為水蛭發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)呢？按照現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點以及文獻報道，心腦血管疾?。ㄒ訟S為代表），糖尿病，腎臟疾病，男科疾病的發(fā)病基礎(chǔ)都指向了內(nèi)皮功能紊亂。我們推測對疾病中內(nèi)皮功能紊亂的改善是水蛭發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)，因此本課題通過模擬人體消化過程制備水蛭酶解提取物(hirudo enzyme extracts，HEE)，在體外研究了其對AS發(fā)病過程中內(nèi)皮功能紊亂保護作用，并初步探索了其作用機制。主要研究內(nèi)容如下:

4、
　　1.內(nèi)皮功能紊亂模型的建立
　　首先采用濃度為10ng/ml的TNF-α作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞Eahy9266h進行誘導(dǎo)，建立內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂模型。采用RT-PCR的方法檢測eNOSmRNA的表達量。eNOS含量測定結(jié)果表明與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)eNOSmRNA的表達量明顯增加(**p＜0.01)，選擇該濃度為誘導(dǎo)濃度。采用MTT和RT-PCR實驗方法篩選最佳藥物作用濃度，實驗結(jié)果表明在HEE濃度為50-800μg/m

5、L時對細(xì)胞活力無影響，并劑量依賴性的上調(diào)eNOS的mRNA表達量，其中200μg/mL作用最明顯，選取200μg/mL為最佳藥物濃度。
　　2.HEE對內(nèi)皮功能紊亂保護作用的研究
　　先將水蛭酶解提取物HEE作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞Eahy92624h，之后采用濃度為10ng/m1的TNF-α誘導(dǎo)6h后研究HEE對內(nèi)皮功能紊亂的保護作用。RT-PCR實驗結(jié)果表明HEE可使eNOSmRNA表達量顯著升高，而使細(xì)胞間粘附分子ICAM-

6、1的mRNA表達量和單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1的mRNA表達量顯著降低。Westernblot實驗結(jié)果表明HEE可使ICAM-1的蛋白表達量和MCP-1的蛋白表達量顯著降低。NO檢測試劑盒結(jié)果表明，HEE可以使NO釋放量顯著增多。粘附實驗結(jié)果表明，HEE可以使內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的粘附率顯著性下降。Transwell遷移實驗結(jié)果表明，HEE可以使單核細(xì)胞遷移率顯著性下降。
　　3.HEE對內(nèi)皮功能紊亂保護作用的機制的探討
　　

7、HEE能夠顯著性抑制NF-κB的主要亞基p65遷移到核內(nèi)，而NF-κB的活化與ICAM-1和MCP-1的表達有關(guān)，因此我們推測HEE對內(nèi)皮功能紊亂的保護作用的機制為通過抑制NF-κB信號通路的活化，從而減少ICAM-1，MCP-1mRNA表達和蛋白合成。
　　本研究表明HEE能夠上調(diào)eNOSmRNA的表達量和NO釋放量，下調(diào)ICAM-1和MCP-1的mRNA表達量和蛋白表達量，并且HEE還可使內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的粘附率和遷移率顯著