豬核移植重編程關(guān)鍵母源因子的篩選及功能研究.pdf

1、體細胞核移植技術(shù)在許多方面都有很大的應(yīng)用前景，但目前核移植效率還普遍很低，人們對核移植重編程機制了解的也還不夠全面。對母源因子的挖掘和研究可以增加人們對核移植重編程機制的認識，進而會提高核移植效率，促進核移植技術(shù)更廣泛的應(yīng)用。近幾年來隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多卵中的母源蛋白，但如何從眾多的母源因子中篩選出對胚胎發(fā)育，特別是對核移植重編程，有特殊作用的蛋白因子成為現(xiàn)在人們著重希望解決的問題。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)大部分的豬

2、體外成熟培養(yǎng)33 h的卵母細胞(33O)已經(jīng)達到了核成熟，然而其核移植之后的克隆胚胎發(fā)育率卻顯著低于一般豬核移植所用的42h的成熟卵(42O)。這可能是因為42O中含有更多的有利于核移植重編程的母源因子，這就為我們針對性的挖掘?qū)毎鼐幊毯驮缙谂咛グl(fā)育起重要作用的母源因子提供了一個契機。在本研究中，我們擬通過對豬33O和42O的蛋白質(zhì)組進行比較，發(fā)現(xiàn)33O和42O之間差異表達的蛋白，并試圖從中發(fā)現(xiàn)一些與核移植重編程有關(guān)的母源因子，從而希

3、望增加人們對核移植重編程機制的了解。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)首先我們利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典技術(shù)路線——2D-PAGE+MALDI-TOF/TOF的方法構(gòu)建了33O和42O的差異蛋白譜。對各10000枚去透明帶的33O和42O中的總蛋白進行比較，最終發(fā)現(xiàn)了994對蛋白點。通過獨立t-檢驗統(tǒng)計分析出了21個差異蛋白點。分離出的差異性蛋白點通過MALDI-TOF/MS分析，最終鑒定出18個差異蛋白，其中7個在33O中高表達，11

4、個在42O中高表達。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白的功能主要集中在卵母細胞成熟，胚胎發(fā)育，表觀修飾，染色體重塑等這些方面。因此，這一差異蛋白譜對人們了解豬卵胞質(zhì)成熟過程中的分子機制提供了寶貴的信息，并且為發(fā)現(xiàn)新的核移植重編程關(guān)鍵的母源因子提供了候選蛋白。
　　(2) Vimentin(VIM)是差異蛋白譜中的一個母源蛋白，VIM在胞質(zhì)成熟時繼續(xù)合成，42O比33O含有更多的VIM。首先我們檢測了VIM在早期胚胎中的表達模式。結(jié)果發(fā)

5、現(xiàn)VIM在卵中高量表達，受精或激活后表達迅速下降，核移植后能夠富集到供體細胞核中，說明VIM可能在核移植重編程早期發(fā)揮功能。接下來，我們在MⅡ卵中注入VIM抗體來干擾其功能，核移植后(anti-VIM NT)發(fā)現(xiàn)核移植囊胚率與注IgG組(IgG NT)和非注射組(control NT)相比顯著下降（12.24％v.s.22.57％，21.10％，P＜0.05）。并且許多anti-VIM NT胚胎阻滯于2細胞或4細胞期。但是，干擾VIM并

6、不影響體外受精胚胎和孤雌胚胎的囊胚發(fā)育率。這說明母源VIM是核移植胚胎正常發(fā)育所必需的。另外我們發(fā)現(xiàn)在干擾母源VIM后，DNA雙鏈斷裂(DSBs)的標(biāo)志——γ-H2Ax水平在克隆胚胎中表達顯著升高，表明干擾母源VIM的克隆胚胎容易發(fā)生DSBs。并且干擾母源VIM后4-細胞克隆胚胎的P53的表達顯著高于對照組。這些結(jié)果表明母源VIM在核移植重編程過程中能夠防止DNA損傷，使P53基因維持低表達，從而有利于克隆胚胎發(fā)育。
　　(3)

7、EZH2是H3K27me3的甲基轉(zhuǎn)移酶，也是一種母源蛋白，我們對它在豬核移植重編程中的影響進行了研究。我們對豬MⅡ期卵母細胞和核移植后6h克隆胚胎中的EZH2進行了免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白在MⅡ期卵母細胞中高表達，核移植后6h時，較多的EZH2蛋白富集到類原核中。向卵中注射EZH2的抗體來干擾其功能，核移植后發(fā)現(xiàn)干擾組2-細胞克隆胚胎的H3K27me3水平顯著低于對照組，同時干擾組的克隆胚胎發(fā)育率顯著比對照組要高(IgG v.s.

8、anti-EZH2，20.60％ v.s.30.63％，P＜0.05)。這說明豬克隆胚胎的H3K27me3水平可能異常高表達，干擾母源EZH2蛋白可能是通過降低了克隆胚胎的H3K27me3水平提高了克隆胚胎的發(fā)育。接下來，我們就對不同時期IVF和克隆胚胎中的H3K27me3的整體水平進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期克隆胚胎的H3K27me3水平高于IVF胚胎，這可能與供體細胞PEF的H3K27me3水平高于精子和卵子密切相關(guān)。于是我們就采用了兩

9、種小分子抑制劑（GSK126和GSK-J4）分別抑制H3K27me3建立和擦除的酶（EZH2和JMJD3/UTX）對細胞和胚胎中的H3K27me3水平進行調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.75μM GSK126處理PEF細胞48h能夠顯著降低細胞的H3K27me3水平，同時處理組的囊胚率顯著高于對照組(DMSO v.s.GSK1260.75μM，21.99％ v.s.31.82％，P＜0.05);另外，雖然GSK-J4可以提高細胞的H3K27me3水平

10、，但處理組和對照組的囊胚率沒有差異。另一方面，在對胚胎進行處理時，我們發(fā)現(xiàn)0.1μM GSK126處理1-細胞克隆胚胎24 h能夠降低克隆胚胎的H3K27me3水平，同時處理組克隆胚胎的囊胚率顯著高于對照組(DMSO v.s.GSK1260.1μM，21.99％v.s.31.33％，P＜0.05)，這與向卵中注射EZH2抗體的結(jié)果相似。而GSK-J4處理胚胎后提高了克隆胚胎的H3K27me3水平，同時降低了克隆胚胎的發(fā)育。最后，我們檢測

11、了降低細胞H3K27me3水平對iPS誘導(dǎo)效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK126在源頭細胞或iPS誘導(dǎo)過程中進行處理都可以提高iPS的誘導(dǎo)效率。這些結(jié)果說明，母源EZH2不利于豬核移植重編程，豬早期克隆胚胎的H3K27me3水平高于受精胚胎，通過抑制母源EZH2來降低克隆胚胎的H3K27me3水平能夠促進克隆胚胎發(fā)育。
　　在本研究中，我們通過對33O和42O的蛋白質(zhì)組進行比較，發(fā)現(xiàn)了18個差異表達的蛋白，8個在33O中高表達，11個