Purα與Egr1對Aβ前體蛋白(APP)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、目的：Purα是嘌呤富集區(qū)元件結(jié)合蛋白家族的一個成員，它結(jié)合形如（GGNGGN）n的單鏈DNA或RNA串聯(lián)序列，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，神經(jīng)退行性病變?nèi)绱嗳鮔染色體綜合征、RNA病毒感染、DNA復(fù)制與修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮著重要作用。Egr1是神經(jīng)活動激活的早期表達(dá)蛋白，它對長期記憶的形成是必須的，在神經(jīng)可塑性基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。APP是一種單跨膜蛋白，它的代謝產(chǎn)物Aβ是Alzheimer病中主要病理產(chǎn)物，被認(rèn)為在AD發(fā)病過程中起

2、著關(guān)鍵作用，而APP本身也在神經(jīng)系統(tǒng)正常功能維持中起著重要作用。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，Purα能下調(diào)APP的表達(dá)，而Egr1則能上調(diào)APP的啟動子活性，兩者作用正好相反。我們通過生物信息學(xué)比對發(fā)現(xiàn)，在APP啟動子的5’ UTR區(qū)中，Purα結(jié)合區(qū)域與Egr1結(jié)合區(qū)域有重疊，因此我們猜測Purα和Egr1對于APP啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可能是通過競爭相互重疊的結(jié)合位點(diǎn)實現(xiàn)的，我們的研究則圍繞這一推測展開。
　　方法：⑴western b

3、lot方法證實Purα和Egr1對APP的相反的調(diào)控作用；⑵通過免疫熒光染色實驗驗證 Purα和Egr1是否共存于細(xì)胞核內(nèi)；⑶分別克隆APP的（-170-+147）區(qū)域、（-100-+147）區(qū)域及其缺失(+63-+82序列的-100-+147)區(qū)域的啟動子區(qū) DNA，構(gòu)建 PGL3-Basic熒光素酶的報告質(zhì)粒。⑷通過熒光素酶報告基因方法分析上述三個報告質(zhì)粒，驗證Purα和Egr1對APP啟動子區(qū)的競爭性調(diào)控機(jī)制。⑸通過CHIP as

4、say驗證Purα和Egr1蛋白和APP啟動子DNA的結(jié)合。⑹通過EMSA實驗進(jìn)一步驗證Purα和Egr1蛋白與APP啟動子區(qū)結(jié)合的精確區(qū)域。
　　結(jié)果：①Purα和Egr1對APP蛋白表達(dá)的調(diào)控作用正好相反，前者下調(diào)而后者上調(diào)；②免疫熒光染色證實Purα和Egr1能在細(xì)胞中共定位；③在報告基因?qū)嶒炛校琍urα和Egr1對兩段APP啟動子片段（-170-+147片段）和（-100-+147），其調(diào)控作用正好相反，Purα起下調(diào)作用

5、，而 Egr1則起上調(diào)作用；④在使用刪掉兩者重疊的（+63-+82區(qū)域的APP啟動子片段進(jìn)行報告基因?qū)嶒炛?，發(fā)現(xiàn)Purα和Egr1對APP啟動子的調(diào)節(jié)作用都消失；⑤CHIP assay實驗證實Purα和Egr1蛋白均對APP的啟動子 DNA有結(jié)合作用；⑥EMSA實驗則進(jìn)一步證實 APP啟動子區(qū)域的+63-+89序列能被Purα和Egr1蛋白結(jié)合，并且二者的結(jié)合互相競爭。
　　結(jié)論：Purα和Egr1通過競爭APP基因5’UTR區(qū)重