ROS激活紡錘體組裝檢查點的作用機制研究.pdf

1、氧自由基具有非常強的氧化作用?；钚匝醮?Reactive Oxygen Species，ROS)是這一類物質(zhì)的統(tǒng)稱，主要包括過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基等。通常情況下，人們會把ROS與疾病和衰老聯(lián)系，因為它能夠氧化細胞中許多組分，包括核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，而這些物質(zhì)的氧化最終會導(dǎo)致細胞死亡與癌變。許多研究報道稱，ROS與許多病癥相關(guān)，包括缺血型再灌注損傷、動脈粥樣硬化、激素缺陷導(dǎo)致的癌癥和慢性炎癥等等除了與一些疾病相關(guān)。ROS是細胞

2、內(nèi)正常的代謝副產(chǎn)物，已有報道其在細胞周期中的作用及影響。本課題就ROS在有絲分裂時期的作用做了初步探討，首次提出了活性氧簇（主要是H2O2）對于有絲分裂紡錘體組裝檢查點（Spindle Assembly Checkpoint，SAC）的激活。
　　細胞增殖過程是通過細胞周期往復(fù)進行的。細胞的有絲分裂時期與間期組成了整個細胞周期。間期主要進行有絲分裂相關(guān)物質(zhì)的積累，為細胞有絲分裂做準(zhǔn)備。有絲分裂是細胞周期中最重要的生命活動，細胞經(jīng)過

3、有絲分裂來實現(xiàn)細胞的增殖，將染色體平均分配到兩個子代細胞中，維持了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。細胞增殖是細胞生命活動中最重要的特征之一，為了使其順利進行，細胞內(nèi)存在一系列的調(diào)控機制，使這一過程在嚴(yán)格的監(jiān)控下無差錯的完成。紡錘體組裝檢查點(SAC)是存在于有絲分裂前中期到中期的過渡階段，是細胞有絲分裂時期的最重要的檢查機制。其功能在于確保有絲分裂中期啟動前所有染色體都被紡錘絲正確捕捉。細胞從有絲分裂前期到后期進行過程中，經(jīng)過SAC的監(jiān)控，當(dāng)所有染色

4、體被正確捕捉，一切工作妥當(dāng)安排后，細胞才能順利進入有絲分裂后期直至走出有絲分裂。當(dāng)SAC信號產(chǎn)生后，作用于效應(yīng)分子Cdc20，SAC蛋白BuRd1，BuRd3和Mad2與Cdc20結(jié)合形成有絲分裂檢查點復(fù)合物（Mitotic CheckpointComplex，MCC），MCC與后期促進復(fù)合物/周期體（Anaphase-promotingComplex/Cyclosome，APC/C）相互作用，使后者呈關(guān)閉構(gòu)象而不能結(jié)合底物，導(dǎo)致后續(xù)進

5、程不能順利進行。SAC信號的產(chǎn)生主要來源于未被紡錘體正確捕捉的染色體，染色體上與紡錘體結(jié)合的動粒組分發(fā)生變化、微管組裝異常以及動粒微管的結(jié)合受到影響，是細胞中SAC信號持續(xù)激活的源頭。本文主要從動粒-微管的連接這一方面討論ROS對SAC信號的激活，而CPC是這一過程中重要的復(fù)合物。
　　CPC(Chromosomal passenger complex)參與有絲分裂時期的許多細胞活動，其早期主要定位于染色體，與一系列周期蛋白共同參

6、與有絲分裂早期的調(diào)控，而后移位至紡錘體中心區(qū)域，參與調(diào)控胞質(zhì)分離。CPC是由其核心激酶原件AuroraB與其它三個負(fù)責(zé)調(diào)控與定位的蛋白(INCENP、Survivin和Borealin)組成。INCENP是CPC復(fù)合物組裝的連接體，其氨基末端是復(fù)合物定位所必需的，與Survivin和Borealin的相關(guān)組分組成一個三體束，共同決定CPC在著絲粒（有絲分裂早期）和紡錘體中心區(qū)域（有絲分裂后末期）的定位。而Aurora B是CPC復(fù)合物發(fā)

7、揮作用的核心，它通過磷酸化相應(yīng)的底物減小紡錘體的張力進而解聚錯誤鏈接的動粒與微管。在有絲分裂時期，細胞需要精確的染色體分離過程，這需要動粒與紡錘體微管雙向并且正確的結(jié)合。CPC復(fù)合物通過其激酶單元Aurora B在動粒-微管結(jié)合的錯配與修復(fù)中發(fā)揮重要的作用。CPC復(fù)合物發(fā)揮動粒-微管錯連修復(fù)作用的同時，產(chǎn)生許多未連接的動粒，這一信號被SAC識別，激活了SAC信號通路。
　　本課題探討了ROS激活SAC進而引起細胞有絲分裂時期阻滯的

8、現(xiàn)象和機理，發(fā)現(xiàn)ROS處理細胞后，細胞停滯在有絲分裂早期而不繼續(xù)向后進行胞質(zhì)分裂。在探究其機理的過程中，發(fā)現(xiàn)ROS的作用對微管的組裝沒有影響，但阻礙了CPC復(fù)合物中Aurora B激酶部分功能的發(fā)揮，故而推測，ROS影響了Aurora B的部分激酶活性，妨礙了它在動粒微管連接中的功能，從而激活SAC。主要本課題首次提出了ROS對于SAC激活的作用，進而對有絲分裂進程產(chǎn)生影響，并且在探尋其機理的過程中，從另外一個角度研究了Aurora B

9、激酶在細胞有絲分裂時期的功能。研究目的:本課題旨在揭示在細胞有絲分裂過程中ROS的作用，探究ROS對于細胞除了DNA氧化損傷外的影響，并尋找其作用機制。大部分的文獻報道都聚焦于ROS對于細胞的氧化損傷，以及與疾病發(fā)生的關(guān)系。主要探究了ROS對于細胞周期進程的影響，越過它在間期對DNA氧化損傷，闡述了ROS在有絲分裂時期對有絲分裂進程的影響，并初步探究了它的效應(yīng)靶點。研究內(nèi)容:本課題研究了ROS對于細胞有絲分裂進程的影響，分析相關(guān)的現(xiàn)象并

10、探究其作用機理。主要研究了H2O2對于細胞有絲分裂狀態(tài)和相關(guān)組分的影響，并分析了與SAC激活相關(guān)的CPC復(fù)合物的功能。最終將目光定于Aurora B激酶的活性，探究了ROS的作用機理。實驗方法:實驗中用H2O2與VK3作為ROS的來源刺激細胞，對細胞核進行染色后用熒光顯微鏡觀察核的狀態(tài)，并統(tǒng)計細胞的有絲分裂比例，以此來研究ROS對于細胞有絲分裂進程影響的現(xiàn)象。并MTT試劑盒檢測了不同細胞對于H2O2的耐受狀況。在探究機理過程中，用免疫熒

11、光實驗方法觀察微管組裝以及Aurora B的定位，用免疫印跡的方法分析相關(guān)蛋白的分子水平以及修飾水平。實驗結(jié)果:在H2O2處理下，以Hela s3為代表的一些細胞發(fā)生了有絲分裂期阻滯（不同的細胞對于H2O2的敏感程度不同）。VK3同樣能對細胞產(chǎn)生與H2O2類似的作用。Aurora B激酶受到H2O2的影響較為顯著，有絲分裂時期在著絲粒上定位減弱，磷酸化水平降低等。同時發(fā)現(xiàn)，與Aurora B共同組成CPC復(fù)合物的INCENP蛋白的磷酸化