聚磷菌多聚磷酸鹽激酶的分子生物學(xué)研究及高效除磷工程菌的構(gòu)建.pdf

1、水體富營(yíng)養(yǎng)化是全球十大環(huán)境問(wèn)題之一，氮磷尤其是磷的輸入是引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵因素。為解決磷污染所帶來(lái)的危害，在污水進(jìn)入水體前進(jìn)行有效處理，降低排放污水的磷濃度十分必要，強(qiáng)化生物除磷工藝(Enhanced biological phosphorus removal，EBPR)是目前世界各國(guó)普遍使用的方法，該工藝具有污泥產(chǎn)生量少、不使用化學(xué)物質(zhì)和運(yùn)行經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。EBPR系統(tǒng)中聚磷菌在磷的去除過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。為此，加大對(duì)聚磷菌的聚

2、磷特性、聚磷相關(guān)基因及聚磷菌的工程化應(yīng)用進(jìn)行研究十分必要。 本文以高效聚磷菌聚磷機(jī)理研究為主線(xiàn)，以一株高效聚磷菌GM6為研究材料，一方面系統(tǒng)研究了ppk1編碼的多聚磷酸鹽激酶被敲除后對(duì)菌體生理生化性質(zhì)的影響，另一方面通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)ppk1編碼的多聚磷酸鹽激酶和PHA操縱元(phaC1-phaZ-phaC2)構(gòu)建了兩株高效除磷工程菌并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已獲得的phaZ突變株對(duì)EBPR系統(tǒng)中碳磷循環(huán)代謝進(jìn)行研究。 1.ppk1突

3、變對(duì)Pseudomonas putida GM6特性的影響及ppk2基因的克隆 ppk基因編碼多聚磷酸鹽激酶，主要負(fù)責(zé)多聚磷酸鹽(Poly-P)的合成。大多數(shù)微生物體內(nèi)編碼PPK的基因都有ppk1和ppk2兩類(lèi)。通過(guò)同源重組敲除ppk1后，突變株在菌體形態(tài)，生理生化等方面發(fā)生顯著變化：通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變株較之原始菌株表面粗糙有凹凸不平感，且部分細(xì)胞一端或兩端同時(shí)有凹陷，生長(zhǎng)速度變慢，代時(shí)增加25％，生物膜形成能力下降5

4、0％，游動(dòng)性與抗逆能力與原始菌株相比顯著降低，這都可能是由于菌體多聚磷酸鹽激酶活性的喪失，使細(xì)胞內(nèi)Poly-P水平降低或是Poly-P鏈長(zhǎng)組成發(fā)生變化，從而引發(fā)細(xì)胞功能的降低或缺失。而突變株與原始菌株相比在除磷能力上并沒(méi)有顯著變化，這可能是由于GM6中還存在著另一個(gè)編碼多聚磷酸鹽激酶的基因(ppk2)。根據(jù)種屬間的同源性，利用快速染色體步移方法克隆了ppk2基因，并將其定向克隆到pET29a載體上進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步研究多聚磷酸鹽激酶的功

5、能打下了基礎(chǔ)。 2.高效聚磷基因工程菌的構(gòu)建 通過(guò)PCR方法從高效聚磷菌株GM6總DNA中擴(kuò)增得到了ppk1、PHA及其自帶的啟動(dòng)子，并定向克隆到pBBR1MCS-5載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMEPE-PPK和pMEPE-PHA，在輔助質(zhì)粒pRK2013的幫助下，通過(guò)三親接合將pMEPE-PPK及pMEPE-PHA轉(zhuǎn)移到原始菌株GM6中，獲得的工程菌p.putida GM6-PPK1和GM6-PHA。兩株工程菌除磷能力