克隆技術(shù)研究論文3000字

1、克隆技術(shù)研究論文 3000 字隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，克隆技術(shù)對整個社會的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了舉足輕重的作用。下面小編給大家分享克隆技術(shù) 3000 字論文，希望能對大家有所幫助！ 克隆技術(shù) 3000 字論文篇一：《試談利用 TAIL―PCR 技術(shù)克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因》 摘要：目的 研究南極磷蝦胰蛋白酶基因的全序列，為低溫酶的基因工程制備建立基礎(chǔ)。方法 以南極磷蝦基因組 DNA 為模板，利用特異性的巢式引物和隨機(jī)引物，通過交錯式

2、熱不對稱 PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR) 克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因序列，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果 測序結(jié)果表明，南極磷蝦胰蛋白酶基因序列全長 961bp，其中含有開放閱讀框(ORF)長度為 798bp，編碼 266 個氨基酸。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進(jìn)一步了解該酶的結(jié)構(gòu)、功能和基因工程制備奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞

3、：南極磷蝦;TAIL-PCR;胰蛋白酶;基因 胰蛋白酶是動物消化系統(tǒng)中主要的一種堿性蛋白水解酶，屬絲氨酸蛋白酶家族，能專一性地水解肽鏈中賴氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽鍵。南極磷蝦因其獨(dú)特的生活環(huán)境，體內(nèi)的胰蛋白酶具低溫高效性，有研究表明，南極磷蝦胰蛋白酶在 37℃和 1～3℃時的活性分別為下游引物，進(jìn)行 1st PCR 反應(yīng)。2st PCR 反應(yīng)將 1st PCR 反應(yīng)產(chǎn)物稀釋 1000 倍，取 1 l 作為 2st PCR 反應(yīng)的模板

4、，以 AP2 Primer 為上游引物，以 SP2 作為下游引物。3st PCR 反應(yīng)將2st PCR 反應(yīng)產(chǎn)物稀釋 1000 倍，取 1 l 作為 3st PCR 反應(yīng)的模板，以 AP2 Primer 為上游引物，以 SP3 作為下游引物。三次反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別參照 Genome Walking Kit試劑盒。反應(yīng)完成后，取 3st PCR 反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收產(chǎn)物與pEASY-T1 Cloning 載

5、體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 Trans1-T1，采用藍(lán)白斑篩選，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后測序。 1.5 克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因 利用已獲得的南極磷蝦胰蛋白酶基因 5 端和 3 端序列設(shè)計(jì)引物，基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同 1.3。擴(kuò)增產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，將 PCR 產(chǎn)物用 QuickGel Extraction Kit 回收后克隆至 pEASY-Blunt Cloning Vector，經(jīng)

6、酶切鑒定重組質(zhì)粒，測序。 2 結(jié)果 2.1 南極磷蝦胰蛋白酶基因 5 端序列 以基因組 DNA 為模板，利用引物 SP1、SP2、SP3與 Genome Walking Kit 提供的隨機(jī)引物 AP1、AP2 進(jìn)行三輪 PCR 擴(kuò)增，僅用隨機(jī)引物 AP2得到預(yù)期的陽性結(jié)果，電泳結(jié)果見圖 1。將圖 1 第二泳道長度接近 250bp 的片段克隆至pEASY-T1 Cloning 載體，酶切驗(yàn)證正確后測序得到一段長為 257bp 的序列，經(jīng)分

7、析，確定這257bp 含胰蛋白酶 5 端及上游 28bp 的序列。 2.2 南極磷蝦胰蛋白酶基因序列分析 以基因組 DNA 為模板，利用基因 5 和 3 端引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果見圖 2。將圖 2 所得的 PCR 產(chǎn)物回收后，克隆至 pEASY-Blunt Cloning 載體，經(jīng)酶切驗(yàn)證后，測序，測得其為一 961bp 的序列，用 GT-AG 法則 [7]分析發(fā)現(xiàn)該片段第 267-429 位置是內(nèi)含

8、子，長度為 163bp;同時具有兩個完整的外顯子區(qū) 1-266 和 430-961。利用 DNATools軟件進(jìn)行分析后，推斷胰蛋白酶含有 266 個氨基酸。經(jīng) Clustal X 軟件和 NCBI Genebank 軟件將推測得到的氨基酸序列與已報(bào)道的胰蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)有較高的相似度。其與凡納濱對蝦胰蛋白酶有較高的相似度(Identities=82%)，與日本囊對蝦、中國對蝦的相似度都達(dá)到了 81%、81%。基因 ORF

9、 見圖 3。 3 討論 胰蛋白酶的研究歷經(jīng)了粗酶提取、分離純化、分子結(jié)構(gòu)、蛋白亞型研究以及基因的研究[10]，每個階段隨著實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)和分析數(shù)據(jù)的增加都帶來新理念的更新和研究領(lǐng)域的擴(kuò)展，現(xiàn)階段甲殼動物胰蛋白酶的研究較少。利用信號肽預(yù)測軟件 SingnalP 推斷南極磷蝦胰蛋白酶的信號肽為 1-14aa，前體蛋白為 1-29aa。和其它甲殼動物的胰蛋白酶序列一樣，南極磷蝦胰蛋白酶的成熟肽的序列同樣是從 Ile-Val-Gly-Gly 開始，