Pseudomonas putida DLL-E41,2,4,-苯三酚1,2-雙加氧酶的晶體結(jié)構(gòu)及兩種農(nóng)藥降解相關(guān)酶的蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究.pdf

1、微生物在污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有重要作用,它們對環(huán)境污染物的降解是通過一系列酶來進(jìn)行的.因此,研究污染物降解過程中關(guān)鍵酶的作用機理,對于闡明微生物對污染物的生物降解過程以及生物修復(fù)機制具有重要意義。蛋白質(zhì)晶體學(xué)是利用X-射線衍射技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的一門學(xué)科,它能使我們從原子角度了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息,結(jié)合蛋白質(zhì)的功能特性,可以確定在實際催化過程中的功能基團(tuán)及其作用方式,為定向改造提供重要信息.本文解析了4-硝基酚類污染物降解途徑

2、中涉及的1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶PnpC在兩種不同結(jié)晶條件下獲得的蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu),并對4-硝基酚類污染物降解過程中涉及的脫硝基酶PnpA,以及在除草劑阿特拉津降解中的脫氯酶AtzA進(jìn)行了初步晶體學(xué)研究。
　　 對硝基苯酚(PNP)是一種重要化工原料,也是多種有機磷農(nóng)藥降解的中間產(chǎn)物,進(jìn)入環(huán)境的PNP會殘留在土壤和水體中,對動植物和人類的健康造成嚴(yán)重危害。PnpC和PnpA是甲基對硫磷降解菌Pseudomonas

3、putida DLL-E4代謝對硝基苯酚類污染物途徑中的兩個關(guān)鍵酶。PnpC作用于1,2,4-苯三酚的1,2位,使其開環(huán)形成馬來酰乙酸。
　　 通過Ni-NTA親和層析及Superdex-200分子篩對重組表達(dá)于E.coli BL21(DE3)pLysS中的PnpC進(jìn)行純化,純酶使用坐滴氣相擴散法利用Hampton research結(jié)晶試劑盒對純PnpC進(jìn)行結(jié)晶條件篩選,優(yōu)化并獲得了兩種不同結(jié)晶條件下的晶體.兩種結(jié)晶條件下所用蛋

4、白質(zhì)濃度均為8 mg/mL,結(jié)晶池母液分別為:(Ⅰ)0.1 M Tris-HClpH7.5,1.3 M硫酸銨和(Ⅱ)0.1 M Hepes·pH7.5,0.8 M檸檬酸三鈉。以硫酸銨為沉淀劑結(jié)晶出的晶體用緩沖液溶解后仍具有酶活力,晶體能衍射到2.32(A),空間群為C121,晶胞參數(shù)為a=82.48,b=38.47,c=107.98,α=90.00°,β=118.06°,γ=90.00°；以檸檬酸三鈉為沉淀劑結(jié)晶出的晶體用緩沖液溶解后失

5、去酶活力,晶體能衍射到1.99(A),空間群為C121,晶胞參數(shù)為a=82.57,b=38.93,c=107.36,α=90.00°,β=118.05°,γ=90.00°。兩種條件下的晶體結(jié)構(gòu)在每個不對稱空間中均只有一個分子,含水量均為46％。通過分子置換,利用來源于Nocardioides simplex3E中的1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶(PDB登記號:1TMX,40％一致性)的結(jié)構(gòu)為模板,解析出這兩種不同結(jié)晶條件下晶體的三維

6、結(jié)構(gòu)。
　　 PnpC的主體由6個較長α螺旋、7個β折疊及轉(zhuǎn)角組成,其主鏈走向與1TMX的主鏈走向一致。PnpC結(jié)構(gòu)分為2個結(jié)構(gòu)域:N端α螺旋結(jié)構(gòu)域(NHD)和C端催化域(CCD),處于CCD的活性中心的四個氨基酸殘基分別為:TYR160、TYR194、HIS218以及HIS220,其中TYR160和HIS218處于同一個平面,并垂直于TYR194和HIS220所在的平面。PnpC的二聚體模型中,兩個單亞基NHD的H1、H3、H

7、4、H5、H6、H7互相作用構(gòu)成二聚體的連接區(qū),而且在連接區(qū)的中心有一個疏水通道,有兩個長鏈磷脂分子貫穿疏水通道,它們的疏水尾部在通道的中心,親水區(qū)在疏水通道的外部。在兩個單亞基NHD組成的連接區(qū)里,一個亞基中的H1和另外一個亞基中的H6距離接近,兩個亞基的H3互相靠近并且反向平行,通道口由H3、H4及H7構(gòu)成,H4、H5中的部分氨基酸殘基參與了通道的構(gòu)成,H5、H7距離CCD的活性中心氨基酸接近。疏水通道主要由兩個亞基分別提供以下氨基

8、酸殘基組成:PHE28、ILE31、LEU35、LEU39、PHE42、LEU48、ILE57、PHE59、LEU60、LEU78、LEU82、ILE76以及ALA208。
　　 PnpC蛋白在兩種不同結(jié)晶條件下的結(jié)構(gòu)的活性中心的四個氨基酸殘基之間的距離不同,以檸檬酸三鈉作沉淀劑的晶體結(jié)構(gòu)中,TYR160和HIS218的距離為2.46(A),TYR194和HIS220的距離為4.23(A),而以硫酸銨作沉淀劑的晶體結(jié)構(gòu)中,TYR

9、160和HIS218距離為2.33(A),TYR194和HIS220的距離為4.70(A)。它們的疏水通道中心的磷脂類尾部也有區(qū)別,檸檬酸三鈉結(jié)晶的晶體的結(jié)構(gòu)該區(qū)域可能連接有一個benzo類似物,并且和兩個分子中的LEU35有作用,而以硫酸銨作沉淀劑的晶體結(jié)構(gòu)中則沒有.
　　 利用 pET表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)從PnpC蛋白質(zhì)序列N端開始,依次截短23、46以及64個氨基酸的三個表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)

10、pLysS中對它們進(jìn)行表達(dá)。它們的表達(dá)產(chǎn)物分別對應(yīng)于從PnpC蛋白質(zhì)的N端結(jié)構(gòu)域中截去一個,兩個、三個組成連接區(qū)的較長α螺旋的突變體,這些表達(dá)產(chǎn)物均失去了催化1,2,4-苯三酚分解的能力。這表明,PnpC NHD的三個α螺旋對PnpC的催化能力是必需的。
　　 對硝基苯酚-4-單加氧酶(PnpA)是一個FAD依賴性單加氧酶,它在NADH和FAD存在下,通過加氧作用使PNP脫硝基生成苯醌。通過Ni-NTA親和層析以及分子篩對重組表

11、達(dá)于E.coli BL21(DE3)pLysS中的PnpA蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。利用坐滴氣相擴散法在293 K初篩并優(yōu)化獲得一個PnpA的結(jié)晶條件:蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL,結(jié)晶池母液為0.1 M Hepes pH7.0,15％PEG4000。該條件下長出的晶體能衍射到2.24(A),空間群為P212121,晶胞參數(shù)為:a=54.47,b=77.56,c=209.17,α:90.00°,β=90.00°,γ=90.00°。通過分子置換找出

12、了PnpA結(jié)構(gòu)的部分主鏈。另外還采集到PnpA浸泡底物PNP、4-NC以及KI的衍射數(shù)據(jù),而且浸泡KI的數(shù)據(jù)中檢測到有異常散射信號。
　　 阿特拉津是國內(nèi)外使用時間長、使用量大的除草劑之一,它的使用已經(jīng)造成了大面積的土壤、水體的污染。阿特拉津脫氯酶(AtzA)催化阿特拉津脫去氯原子,變成毒性較低的羥基阿特拉津。關(guān)于AtzA酶學(xué)以及生物修復(fù)方面的研究較多,但仍未有結(jié)構(gòu)報道。從阿特拉津降解菌Pseudomonas sp.SA1中擴增

13、出阿特拉津脫氯酶基因atzA,構(gòu)建表達(dá)載體 pET29b-atzA,在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中進(jìn)行了高效表達(dá),通過硫酸銨沉淀、離子交換、分子篩對其進(jìn)行了純化,純酶在293K條件下使用懸滴氣相擴散法和坐滴氣相擴散法均能篩選到蛋白質(zhì)晶體,優(yōu)化獲得的較穩(wěn)定結(jié)晶條件下,晶體能衍射到4(A),蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL,結(jié)晶池母液為0.1M檸檬酸三鈉pH5.6、12％MPD以及13％PEG4000.
　　 綜上所述,本文解