同位素分析法

1、同位素分析法,張玉杰2009年,一、概念-同位素分析,單獨(dú)使用同位素標(biāo)記檢測(cè)（技術(shù)）或與其他方法相結(jié)合或以同位素豐度比值進(jìn)行藥物體內(nèi)外分析的方法。,第一節(jié) 概 述,二、同位素分析法的特點(diǎn),精密度和靈敏度高；劑量小； 方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好； 提供原子、分子水平的研究手段(微觀作用機(jī)理、動(dòng)態(tài)變化過(guò)程) 合乎生理?xiàng)l件(不擾亂體內(nèi)生理過(guò)程的平衡狀態(tài)) 定量、定位準(zhǔn)確； 缺點(diǎn)與局限（放射性同位素） 需專用的實(shí)驗(yàn)條件；

2、 一定專門訓(xùn)練的技術(shù)人員； 實(shí)驗(yàn)中需要采取必要的防護(hù)措施; 同位素效應(yīng)問(wèn)題.,三、同位素法的基本依據(jù),一種元素的同位素具有相同的化學(xué)性質(zhì)自然界中核素的豐度是一個(gè)確定的值 以碳元素為例，穩(wěn)定同位素有12C和13C兩種形式，分別占總額含量的98.893%和1.107%(共100%)。放射性同位素具有物質(zhì)性質(zhì)差異的可測(cè)性,四、同位素分析法的分類,穩(wěn)定同位素——穩(wěn)定同位素分析法 放射性同位素——放射

3、性同位素分析法,,六、同位素分析的主要應(yīng)用領(lǐng)域,藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用（放射和穩(wěn)定核素示蹤）制劑體內(nèi)運(yùn)行規(guī)律研究（靶向，定位釋放）生物樣品中微量物質(zhì)的分析藥物作用機(jī)理和藥效評(píng)價(jià)的研究（物質(zhì)代放謝的研究，物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究 ）藥物開發(fā)研究中的應(yīng)用重要性：,第二節(jié) 核物理基本知識(shí),一 原子結(jié)構(gòu),1.原子結(jié)構(gòu) 表示: AX 如：131I, 125I，18F電子排布：2n2原子質(zhì)量數(shù)：原子基態(tài)與激發(fā)態(tài)：原子核的穩(wěn)定性：

4、,2.同位素、核素、同質(zhì)異能素,同位素是指質(zhì)子數(shù)相同而質(zhì)量數(shù)（中子數(shù)）不同的原子。 1H，2H和3H；12C，13C和14C 互為同位素。,同位素,核素,原子核的質(zhì)子數(shù)、中子數(shù)和原子核所處的能量狀態(tài)均相同的原子，舉例： 1H，2H，12C，13C，125I,同質(zhì)異能素 原子核的質(zhì)子數(shù)、中子數(shù)都相同但原子核所處的能量狀態(tài)不同的核素。 基態(tài)與激發(fā)態(tài)，表示方法99Tc和99mTc

5、 99mTc與99Tc互為同質(zhì)異能素,二 放射性核素及其衰變特征,放射性核素: 放射性同位素的原子核很不穩(wěn)定，會(huì)不間斷地、自發(fā)地放射出射線，直至變成另一種穩(wěn)定同位素，這就是所謂“核衰變”。 226Ra→α,β粒子和γ射線→222Rn穩(wěn)定性核素: 穩(wěn)定性同位素?zé)o放射性，物理性質(zhì)穩(wěn)定，以一定比例存在于自然界，對(duì)人體無(wú)害，可采取化學(xué)合成的方法將其標(biāo)記到藥物分中去，在生物樣本中的標(biāo)記藥物和未標(biāo)記藥物的濃度可運(yùn)用

6、GC-MS或LC-MS方法同時(shí)被檢測(cè)。常用的穩(wěn)定同位素有2H、13C、15N和18O四種,1.放射性核素,2. 放射性核衰變:,放射性核素的原子核自發(fā)地放出射線，并轉(zhuǎn)變成新的原子核的過(guò)程； 衰變規(guī)律：原子核衰變時(shí)前后的電荷數(shù)和質(zhì)量數(shù)都守恒。 舉例 32-15P → 32-16S +β- 規(guī)律： MZX → M-4Z-2Y + He(α) MZX → MZ+1Y + β,3.放射性核素的特

7、點(diǎn),放射性核素在進(jìn)行核衰變的時(shí)候，可放 射出α射線、 β射線、γ射線和電子俘 獲等，但是放射性核素在進(jìn)行核衰變的 時(shí)候并不一定能同時(shí)放射出這幾種射線; 放出的射線由原子核決定的; 放射性核素具有一定的壽命。,4.半衰期,即一定數(shù)量放射性同位素原子數(shù)目減少到其初始值一半所用的時(shí)間 如：32P 的半衰期為14.3天，即原來(lái)有100萬(wàn)個(gè)32P原 子，經(jīng)過(guò)14.3天后，只剩下50萬(wàn)個(gè).,5. 放射性

8、核衰變的類型,α衰變 β-衰變 β＋衰變（正電子衰變） 電子俘獲衰變 γ衰變,(1) α衰變,不穩(wěn)定原子核自發(fā)地放射出α粒子而變成另 一核素的過(guò)程稱作α衰變。,,,α粒子 由2個(gè)質(zhì)子和2個(gè)中子組成（氦原子核），帶正電荷。 α粒子（射線）的特性： 電離和激發(fā)能力強(qiáng); 穿透能力較差。,(2) β-衰變,如： 由32P到32S的衰變 32P → 32S +β-

9、 + v + Q,不穩(wěn)定原子核自發(fā)地放射出β-粒子而變成另一核素的過(guò)程稱作β-衰變。,β- 粒子（射線） 是高速運(yùn)動(dòng)的負(fù)電子流β- 粒子的特性： 穿透力弱 電離和激發(fā)作用較強(qiáng),(3) β＋衰變（正電子衰變）,由于核內(nèi)中子缺乏致使放射出正電子的衰變，稱為正電子衰變或β＋衰變。,如； 18 F → 18 O +β＋ + v + Q,正電子的特性: 射程只有１～2mm,主要用

10、于醫(yī)學(xué)顯像診斷。,(4) 電子俘獲衰變,原子核俘獲一個(gè)核外軌道電子使核內(nèi)一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)變成一個(gè)中子，發(fā)生在缺中子的原子核. 如： 125I + e → 125Te+ γ,核外電子被俘獲進(jìn)原子核內(nèi)，外層電子向內(nèi)層補(bǔ)充，放射出X射線 或?qū)⒛芰總鹘o更外層電子使其成為自由電子（俄歇電子）,（3）電子俘獲后，有時(shí)原子核還有較高能量，處于激發(fā)態(tài)，放射出γ射線而回復(fù)到基態(tài)。

11、（4）或把能量轉(zhuǎn)給一個(gè)核外電子，使之發(fā)射出去，稱為內(nèi)轉(zhuǎn)換電子。,電子俘獲衰變核素所發(fā)射的特征Ｘ射線、γ射線可用于核素顯像（如111In, 67Ga,201TI）,電子俘獲衰變核素125I廣泛用于體外分析中。,(5) γ衰變,激發(fā)態(tài)的原子核以放射出γ射線（光子）的形式釋放能量而躍遷到較低能量級(jí)的過(guò)程稱作γ衰變。常繼發(fā)在α、β- 衰變后。 如： 99mTc的衰變 　　　99mTc　→　99Tc?。ˇ谩。?

12、γ射線: 是中性的光子流γ射線的特性: 電離能力很小，穿透力最強(qiáng)，射程最大， 1MeV的γ射線在空氣中的射程約有1米之遠(yuǎn)； γ射線作用于物質(zhì)可產(chǎn)生光電效應(yīng)、康普頓 效應(yīng)和電子對(duì)效應(yīng)，它不會(huì)被物質(zhì)完全吸 收，只會(huì)隨著物質(zhì)厚度的增加而逐漸減弱。,三 射線與物質(zhì)的相互作用,（一）帶電粒子與物質(zhì)的作用 1 電離作用 2 激發(fā)作用 3 散射作用 4 軔致輻

13、射 5 吸收作用,,,電離作用,是指α、β等帶電粒子使物質(zhì)中的原子失去軌道電子而形成自由電子和正離子的過(guò)程。 入射粒子的電荷量越大，電離作用越強(qiáng)； 所以，α粒子的電離本領(lǐng)比β粒子大得多； 若脫離出來(lái)的電子的能量足夠大，它又可使其他原子電離，稱為次級(jí)電離； 在單位路徑中形成的離子對(duì)數(shù)為電離密度，是反映電離本領(lǐng)的指標(biāo)。,激發(fā)作用,帶電粒子通過(guò)物質(zhì)時(shí)，原子的電子獲得能量而使其從內(nèi)層軌道跳到外層軌道，這時(shí)原子從穩(wěn)定狀

14、態(tài)變成激發(fā)狀態(tài)，這種作用成為激發(fā)作用； 被激發(fā)的原子極不穩(wěn)定，很快由激發(fā)態(tài)退回到穩(wěn)定的基態(tài)同時(shí)放出X射線以釋放多余的能量。,* 電離和激發(fā)作用是一些探測(cè)器工作的物質(zhì)基礎(chǔ)，是射線引起物理、化學(xué)變化和生物效應(yīng)的機(jī)制之一。,散射作用,β射線由于質(zhì)量小，行進(jìn)途中易受介質(zhì)原子核靜電場(chǎng)的作用而改變?cè)瓉?lái)的運(yùn)動(dòng)方向，這種現(xiàn)象稱為散射。一般帶電粒子在物質(zhì)中通過(guò)可能經(jīng)過(guò)多次散射。,高能量快速運(yùn)動(dòng)的β粒子，突然被原子序數(shù)高的物質(zhì)（如鉛）阻止

15、后，急劇降低速度，電子的一部分或全部動(dòng)能轉(zhuǎn)化為連續(xù)能量的X射線發(fā)射出來(lái)，這種現(xiàn)象叫軔致輻射。 它發(fā)生的幾率與β射線的能量和物質(zhì)的原子序數(shù)成正比，因此在防護(hù)上采用低密度材料，以減少軔致輻射。β射線能被不太厚的鋁層等吸收。,軔致輻射,吸收作用,帶電粒子使物質(zhì)的原子發(fā)生電離和激發(fā)的過(guò)程中，射線的能量全部耗盡，射線不再存在稱做吸收作用。帶電粒子在物質(zhì)中沿運(yùn)動(dòng)軌跡所經(jīng)過(guò)的距 離稱為射程。帶電粒子的能量損失與粒子的動(dòng)能和

16、吸收 物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，所以射程能比較直觀地 反映帶電粒子貫穿本領(lǐng)的大小。,（二）光子與物質(zhì)的相互作用,1 光電效應(yīng)2 康普頓效應(yīng) 3 電子對(duì)生成,光電效應(yīng),γ光子與靶物質(zhì)原子相互作用，γ光子的全部能量轉(zhuǎn)移給原子中的束縛電子，使這些電子從原子中發(fā)射出來(lái)，γ光子本身消失。留下的電子空位立即被外層電子填充，隨即發(fā)射X射線和俄歇電子。 發(fā)射出的電子稱為光電子，光電子按β粒子同樣的方式，將其能量電離，其它原子

17、則消耗掉。,光電效應(yīng),康普頓效應(yīng),入射γ光子與原子的核外電子發(fā)生非彈性碰撞，光子的一部分能量轉(zhuǎn)移給電子，使它反沖出來(lái)，而光子的運(yùn)動(dòng)方向和能量都發(fā)生都發(fā)生了變化，成為散射光子； 康普頓電子象光電效應(yīng)中的情況一樣，按與β粒子相同的方式消散它的能量，散射光子進(jìn)一步通過(guò)光電或康普頓過(guò)程被吸收。,康普頓效應(yīng),電子對(duì)效應(yīng) ——,γ光子與靶物質(zhì)原子的原子核庫(kù)侖場(chǎng)作用，光子轉(zhuǎn)化為正 - 負(fù)電子對(duì)。,電子對(duì)生成效應(yīng),第三節(jié) 放射性強(qiáng)度及其度量單位,

18、1Bq=1s-1 1Ci=3.7×1010Bq 1Bq=2.7×10-11Ci 1 mCi=37 MBq 1μCi= 37 kBq,放射性強(qiáng)度是指單位時(shí)間內(nèi)發(fā)生衰變的原子核數(shù),單位用貝可（becque

19、red, Bq ）表示, 為1秒鐘內(nèi)發(fā)生一次核衰變。,1 放射性強(qiáng)度(放射性活度),1kBq=103Bq1MBq=106Bq1GBq=109Bq,2 比放射性強(qiáng)度（比活度）,表示單位重量藥物中含有的放射性強(qiáng)度(活度)。以此表示物質(zhì)中放射性核素的含量. C = A/m C: 放射性比活度,單位是Bq/g, MBq/g, MBq/mol A: 核素的放射性強(qiáng)度,單位是Bq

20、 m: 物質(zhì)的質(zhì)量,單位是g放射性濃度 單位體積溶液中所含的放射性活度，單位是Bq/ml, Bq/L, mCi/ml。,3 放射性化學(xué)純度（放化純度）,供使用的放射性藥物中所需要的標(biāo)記藥物的放射性強(qiáng)度占總放射性強(qiáng)度的百分比。 一般要求>90～95%,第四節(jié) 放射性同位素的檢測(cè),一.方法(閃爍計(jì)數(shù)法)γ計(jì)數(shù)法： 放出γ射線的同位素（125I）及其標(biāo)記藥物的檢測(cè)（簡(jiǎn)單）液體閃爍計(jì)數(shù)法：

21、 用于檢測(cè)低能β-射線發(fā)射體（如3H，14C及其標(biāo)記藥物）（復(fù)雜）,測(cè)量結(jié)果表示,計(jì)數(shù)率—射線每分鐘的計(jì)數(shù)次數(shù)（cpm） Bq = cpm /E Bq 放射性強(qiáng)度（每分鐘衰變數(shù)） cpm 計(jì)數(shù)率 E 計(jì)數(shù)效率計(jì)數(shù)效率（探測(cè)效率）： 被探測(cè)的放射性物質(zhì)所放射的總粒子或總光子與探測(cè)系統(tǒng)所記錄的脈

22、沖數(shù)之比稱探測(cè)效率E E= 記錄到探測(cè)系統(tǒng)的脈沖數(shù)/射向探測(cè)器源發(fā)射總粒子數(shù)×100%,二 γ計(jì)數(shù)法,（一）探測(cè)原理 其與物質(zhì)作用的機(jī)制是：光電效應(yīng)，康譜頓效應(yīng)和生成電子對(duì)后產(chǎn)生次級(jí)電子—引起物質(zhì)電離和激發(fā).,γ射線 → 碘化鈉（光電效應(yīng)，康譜頓效應(yīng)和生成電子對(duì)）→ 次級(jí)電子 → 光子（熒光） → 光電倍增管,三 液體閃爍計(jì)數(shù)法,1 探測(cè)原理閃爍體溶液：由溶劑和溶質(zhì)（又稱閃

23、爍體）組成。溶劑——吸收輻射能量和溶解樣品的作用溶質(zhì)（閃爍體）——從受激溶劑分子得到能量，然后發(fā)出閃光（熒光）（1）溶劑 常為芳香族化合物，如：甲苯（親脂性放射性藥物），二氧雜環(huán)己烷（親水性放射性藥物）,（2）溶質(zhì)（閃爍體）,高效熒光體有機(jī)分子,閃爍液產(chǎn)生光子的過(guò)程：,α，β射線 溶劑分子吸收 溶劑分子吸收hv激發(fā) 發(fā)射光子光子→閃爍體吸收hv發(fā)出光子→光電倍增管,2 樣品制備,使待測(cè)樣品充分溶解在閃爍

24、體溶液中，使放射能盡量轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽?；排除樣品中熒光淬滅物質(zhì)的干擾可使用增溶劑等，不溶物可制成乳劑等。顏色較深者，可采用氧化脫色或氧化成無(wú)機(jī)物。,第五節(jié) 藥物研究中常用的放射 性同位素及注意事項(xiàng),一 藥物研究常用放射性同位素,物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化研究:3H,14C,32P;體外放射分析:125I;臨床臟器功能測(cè)定和顯像:131I,99mTc,111In,1.3H（氚）,氫（1H）這種元素有兩種同位素2H和3H；在自然

25、界中氫主要以1H的形式存在；3H的半衰期比較長(zhǎng)，標(biāo)記藥物在使用期間不用考慮放射性強(qiáng)弱的衰減問(wèn)題 ；放出的是能量較低的軟β射線注意問(wèn)題,2.14C,自然界中碳的同位素主要是12C，13C，14C是人工制取的。14C的標(biāo)記也比較困難，但其一般成為有機(jī)化合物骨架的一部分，代謝過(guò)程中一般不會(huì)失去。,3.125I,125I有合適的半衰期;標(biāo)記物很容易制備;放出γ射線能量高，很容易用γ測(cè)定儀測(cè)出，因 此應(yīng)用非常普遍;由于其放出的γ

26、射線能量較高，對(duì)人體有傷害， 因此要特別注意防護(hù)。,4 99mTc,是99Tc的激發(fā)態(tài);它的半衰期只有6.01小時(shí);由99Mo-99mTc發(fā)射器獲得;發(fā)射單純低能γ射線，能量為140KeV;由于99mTc的化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡菀讟?biāo)記各種化合 物，射線能量合適，產(chǎn)生的圖像質(zhì)量很高，因此被廣 泛用于醫(yī)學(xué)科研與臨床。,二 放射性同位素使用中的注意事項(xiàng),1.同位素效應(yīng) 是指同位素標(biāo)記藥物后引起藥物理化性質(zhì)的變化

27、 2.放射性的危害 　內(nèi)照射 外照射,3.防護(hù)的必要性,（1）試驗(yàn)人員的自我防護(hù)　　　　　3H，14C要防止內(nèi)輻射 125I要防止外照射（2）放射性去污染和放射性廢物處理 廢液 固體,第六節(jié) 放射性標(biāo)記物的制備,一 標(biāo)記方法（一） 125I標(biāo)記 I原子的化學(xué)性質(zhì)活潑，可采用取代反應(yīng)將其標(biāo)記在藥物上。 氯胺T法 碘原法（

28、Iodogen）,,氯胺T是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。 氯胺T（或H2O2）+ 2*Iˉ→ *I2 + 2OHˉ,.氯胺T法,終止碘化反應(yīng)：加入還原劑偏重亞硫酸鈉, 以終止碘化反應(yīng)層析純化:,2 碘原法（Iodogen）,原理　用Iodogen為氧化劑，對(duì)蛋白質(zhì)和多肽抗原進(jìn)行碘化標(biāo)記，把125I直接引進(jìn)分子中的酪氨酸殘基上。標(biāo)記后取出樣品即停止反應(yīng)，不使用任何還原劑。,方法(1)

29、標(biāo)記之前，先把Iodogen溶于有機(jī)溶劑，涂于管底，并使之干燥。(2)標(biāo)記時(shí)，將蛋白質(zhì)溶液置于反應(yīng)管中，反應(yīng)管置于冰浴中。碘化時(shí)，125I與蛋白質(zhì)克分子之比例為1～1.2。反應(yīng)時(shí)間在溫和的連續(xù)的攪拌下可達(dá)10min，從反應(yīng)管中轉(zhuǎn)移出反應(yīng)混合液，使其反應(yīng)停止。,（二） 3H標(biāo)記,非定位：氣體曝射法（同位素交換法），即將 藥物與氚氣密封在一起，放置幾天或數(shù)周， 使氚與藥物分子中的1H發(fā)生交換；氚可與藥物分子中的1H發(fā)生多處交換

30、，因此只 能得到非定位標(biāo)定的藥物；定位標(biāo)記：特殊合成路線，將3H引入藥物結(jié)構(gòu) 中的指定位置，常用的方法是對(duì)藥物雙鍵部位 催化加氚（加成）。困難,（三）14C標(biāo)記,同3H標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記也比較困難，起始試劑為14CO2或Ba14CO3。,3 放射性標(biāo)記化合物的純化與鑒定,凝膠過(guò)濾法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P 系列。分離標(biāo)記蛋白與無(wú)機(jī)碘時(shí)，通常用Sephadex G— 25或G—50，

31、然后用G—100進(jìn)一步純化。離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化 短肽標(biāo)記物。透析法　能將標(biāo)記蛋白與小分子化合物很好地分離。電泳法可用來(lái)分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質(zhì)。,（1）純化標(biāo)記化合物的常用方法,親和層析法利用蛋白質(zhì)與其特異抗體或受體的結(jié)合來(lái)分離、純化標(biāo)記蛋白質(zhì)。此法特異性強(qiáng)，保持生物活性好，但操作較復(fù)雜。高效液相層析法此法最大優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、快速，但需特殊設(shè)備。伴刀豆球蛋白A（ConA）

32、吸附法ConA是一種植物凝集素，對(duì)糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標(biāo)記糖蛋白。吸附的標(biāo)記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。 然后測(cè)定標(biāo)記效率和比活性。,（2）標(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo),放射化學(xué)純度； 放射性比活度； 生物活性和免疫活性； 標(biāo)記位置和定量分布情況等。,放射化學(xué)純度及放化純度鑒定,放射化學(xué)純度：放射性核素標(biāo)記化合物都是以一定的化學(xué)形態(tài)存在的，所以：　　放射化學(xué)純度（%）

33、=特定化學(xué)形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度×100放射化學(xué)純度的測(cè)定方法： 原則是高效的化學(xué)分離與靈敏的放射性測(cè)量相結(jié)合。常用下列方法： ① 放射層析法，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術(shù)使混合物中各組份分離，然后測(cè)定各組份的放射性活度。 ② 放射性高效液相層析法：,生物活性,①物理化學(xué)方法：可用電泳 法、吸附法及凝膠過(guò)濾法等物理化學(xué)方法來(lái)測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變情況;②特異結(jié)合試驗(yàn)： ③生物特性測(cè)定：