1890型pcr熒光分析儀

1、1890型PCR熒光分析儀,介紹及應用,實時熒光定量PCR的應用,臨床方面的應用 ? 疾病的臨床早期診斷 ? 建立病原體病分子診斷標準 ? 療效考評 ? 指導制訂感染性疾病合理治療方案 ? 了解感染性疾病病人用藥后病情的變化情況 ? 醫(yī)院、血站及防疫站的確診 ? 新藥研究中藥物的作用效果? 研究Elisa方法的漏檢率 ? 病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測定，為疾病治療進行指導,遺傳病診斷中的應用? 等位基因檢測?

2、 多基因遺傳病的突變檢測 ? 基因表達異常所致遺傳病檢測 在腫瘤診斷中的應用? 腫瘤相關基因表達的檢測? 腫瘤標志物（肽類激素和酶）? 腫瘤耐藥基因（MDR）,何謂PCR ?,聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)簡稱ＰＣＲ，是一項在短時間內大量擴增特定的ＤＮＡ片段的分子生物學技術。,試劑的定量原理：,Taqman水解探針定量Roche雜交探針定量分子信標定量SYBR Green Ⅰ染料定

3、量,,,,雜交探針,分子信標,熒光能量共振轉移,,Taqman探針,,,,Taqman探針、雜交探針、分子信標都是通過熒光能量共振轉移直接或間接的產生特定波長的熒光，使儀器能檢測到,PCR的發(fā)展史,這項技術的發(fā)明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技術 公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段ＤＮ Ａ的技術問題，有一天晚上他驅車在北部加州１０１號高速公路上，靈機一動想到了一個實際上可以無限

4、擴增某段ＤＮＡ的簡單方法，即ＰＣＲ。 在１９８５年的一次學術會議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學家 中也引起了強烈的反應。Ｃｅｔｕｓ給了Mullis一萬美元的獎金，隨后 把這項技術的專利以三億美元的價格轉讓給另一家生物高技術公司。在短 短的幾年內，ＰＣＲ迅速成為分子生物學的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛 的實際應用，被許多科學家視為近十年來分子生物學領域最重要的一項技 術突破。１９９３年，Mullis因此獲得諾貝爾化學獎。,PCR原理和

5、方法: (一),眾所周知，ＤＮＡ是由四種堿基按互補配對原則（即腺嘌呤Ａ對胸腺 嘧啶Ｔ，鳥嘌呤Ｇ對胞嘧啶Ｃ）組成的螺旋雙鏈。在細胞內，ＤＮＡ復制 時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，另一種酶--ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）結合到ＤＮＡ模板上，最 后，ＤＮＡ合成酶以這段引物為起點，合成與ＤＮＡ模板配對的新鏈。ＰＣＲ即是在體外模擬ＤＮＡ復制的過程，它用加熱的辦法讓所研究的ＤＮＡ片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引

6、物讓它們結合到ＤＮＡ模板的兩端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量復制該模板。 假定我們要研究的ＤＮＡ雙鏈兩端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　在ＰＣＲ之前，我們首先人工合成兩段有２０－３０堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一

7、端配對，比如一條是（為與模板能夠區(qū)別，以小 寫表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一條就是tttacggatcggcaacctat。 把這兩段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合 在一起，我們就可以開始做ＰＣＲ了。,PCR原理和方法: (二),第一步叫“變性”，把樣品加熱到９４－９６攝氏度一到數分鐘，讓 ＤＮＡ模板變性變成單鏈?！　〉诙浇小巴嘶稹保寴悠返臏囟认陆档剑担埃叮禂z氏度一到數分鐘，引物

8、就可以結合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　　第三步叫“延伸”，讓樣品的溫度上升到７２攝氏度

9、一到數分鐘，ＤＮＡ聚合酶就可以從引物開始用底物復制出新鏈。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAA

10、AGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　　這樣經過三步一個循環(huán)，一條雙鏈就變成了兩條，再來一個循環(huán)，就變成了四條……在一個由計算機控制的循環(huán)加熱器上經過三十個循環(huán)，就可以把原來的樣品精確地擴增了２的３０次方倍，而這只需要兩三個小時。,影響PCR特異性的因素,退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸

11、。 引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。 模板中如果存在次級結構，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結構時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7G

12、TP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產物的生成。,擴增反應可以無窮進行下去嗎？,答：不可以。因為經過一定的循環(huán)周期后需擴增的片段不再按指數增多而逐漸進 入平坡，進入平坡的循環(huán)次數，取決于起始時存在的模板拷貝數以及合成的DNA總量。 所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產物達0.3～1pmol時，由于產物的

13、堆積，使原 來以指數增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進入平坡的原因有： ? 引物和dNTP等消耗完畢 ? Taq酶失活 ? 底物過剩 ? 非特異性擴增產物的競爭 ? 退火時產物的單鏈自己締合 ? 變性在高濃度產物條件下，產物解鏈不完全，以及最終產物的阻化作用?。ń沽姿峄p鏈DNA）。,總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然后稍稍改變各參數，可以達到優(yōu)化，以取得優(yōu)良

14、的特異性和產率。,實時熒光定量PCR 的Ct值,,,,由圖我們也可以看出，在Ct值所在處重復性驚人的好。,Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。由于所設閾值都很低，所以Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性,,Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。,,,由圖可以看到當擴增越靠后定量的重復性就越差。主要是因為①熒光定量技術要求在低濃

15、度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復雜，而PCR擴增產物是高濃度的，因此重復性變差也很容易理解。②由于擴增末期，擴增效率可能因為大量的靶序列而產生不可控的影響。,,儀器的Ct值定量原理,固定循環(huán)數后，熒光信號與模板數成正比，但當固定熒光信號值后，模板數就與循環(huán)數成反比。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。只要獲得未知樣品的Ct值，

16、即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。,橫坐標代表起始拷貝數的對數,,縱坐標代Ct值,利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,1890型PCR熒光分析儀的特點,高速的加熱降溫循環(huán)系統(tǒng)采用長壽命的LED激發(fā)光源可對PCR擴增全過程進行實時動態(tài)監(jiān)測無需開啟PCR反應管，可避免在PCR期間及PCR之后產物污染，確保結果準確,可用三種不同報告染料同時用于一個樣品，在單一反應中取得更多信息全中文界面，靈活的程序設定、全面的分析和報告

17、功能，全部參數可儲存可打印多個或單個樣本報告,儀器主要技術規(guī)格,樣本數： 32 反應管（光學玻璃管）長： 35mm 容積（反應體積） 10-20ul 溫度范圍： 40℃-98℃ 溫度控制： 1℃/S-10℃/S 激發(fā)光波長： 47

18、0nm（LED） 發(fā)射光波長： 530，640，710nm 檢測靈敏度： 可在一個基因組中檢測單拷貝 軟件操作系統(tǒng)： Win2000 輸入電源/功率： AC220V 50HZ/800VA,儀器工作原理 （一）,,儀器工作原理 （二）,圖一蓋中的加熱器在計算機控制下向熱室中交,替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風扇電機,攪勻，由于空氣無

19、有效質量，熱室可以迅速達到,設置溫度，由此進行PCR的溫度循環(huán)。32個樣品,在周向馬達的帶動下逐一經過信號采集的光學系,統(tǒng)，為采樣的準確定位光學結構由絲桿馬達進行,微調。由長壽命的LED光源(470nm)激發(fā)毛細,管中的熒光，該熒光通過一組復合濾鏡和透鏡分,別同時到3個接收器上(520nm,640nm,710nm),完成了儀器的實時采樣。,強大的軟件功能,參數設置功能（包括溫度、時間、循環(huán)數、 升降溫速率、檢測通道選擇）樣

20、本資料記錄功能文件運行顯示功能（PCR熱循環(huán)數據顯示、熒 　　光檢測數據顯示）檢測數據分析功能分析結果輸出功能故障保護和報警功能,先進的光路系統(tǒng),選用長壽命LED激發(fā),無需預熱，無需校正采用了先進的非球面鏡設計，提升了儀器的光學性能，縮短了光程，使儀器更小巧優(yōu)質的濾光片，硬膜鍍膜技術，窄帶低背景高透過率不霉變實時三色熒光檢測，盡善盡美,傳統(tǒng)96孔板和離心毛細管比較,毛細管 96

21、孔板?標本量小，耗材成本稍高 ? 標本量大，耗材成本低?由于離心，每個樣品孔間溫度 ?由于加熱模塊的邊緣效應，每個 均勻一性好 樣品孔間溫度存在差異?加熱介質空氣與反應體系無縫 ? 96孔板反應面積大，故升降溫 接觸，接觸面積大，故升降

22、 速度慢 溫速度快 ?一個40個循環(huán)的實驗只需30-45 ?一個40個循環(huán)的實驗需要2小時 分鐘 ?光源與檢測器對每個樣品來說 ?每個樣品孔距離光源和檢測器 是等距離的，減少了系統(tǒng)誤 光程不同，可能對結果產生 差 影響,,,

23、由于定量PCR必須借助于樣本和標準品之間的對比實現(xiàn)定量，旋轉的樣品架很好地解決了樣品孔間的均一性，最大程度的保證了標準曲線與樣品之間條件的一致性，避免了微小差別被指數級發(fā)大。,,,優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學范圍,儀器能在7個數量級的范圍內得到非常好的線性結果。相關系數（r）可達3個9。且有優(yōu)異的靈敏度和極佳的重復性,友好方便的操作界面,方便的樣品編輯界面,,方便的溫度循環(huán)設置界面,,一目了然的運行界面,,● 時實反應了當前樣