dna限制性內(nèi)切酶消化酶切

1、實驗三 DNA限制性內(nèi)切酶 消化酶切,實驗原理,限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。,限制性內(nèi)切酶可分為三類,Ⅱ類限制性內(nèi)切酶,Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割, 產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互

2、補的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5',實驗材料和試劑,實驗材料： 玉米基因組DNA實驗試劑：BamH I 酶及其酶切緩沖液：購買成品。 SalI酶及其酶切緩沖液：購買成品。瓊脂糖(Agarose)：進口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均

3、可。,實驗儀器,恒溫水浴鍋,,用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底,混勻反應體系后，37℃水浴保溫2-3h,電泳檢測,EP管編號,,,,實驗步驟,反應體系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT

4、 3μL,對質(zhì)粒DNA酶切反應,限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶, 消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應時間也要適當延長。,電泳檢測示例,實驗注意事項,限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應時間也要適當延長。 酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反

5、應。 許多實驗制備的DNA不易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應。 市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影響。,思考題,如果一個DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被酶切或者酶切不完全, 你認為可能是什么原因？,