解決糧食短缺控制疾病危害，延長(zhǎng)人類(lèi)壽命治理環(huán)境污染-my數(shù)位學(xué)習(xí)

1、第三章細(xì)胞與選殖技術(shù),■細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能　細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)　細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立　細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能　細(xì)胞學(xué)的研究方法　細(xì)胞學(xué)研究的思考,結(jié)束放映,■細(xì)胞選殖技術(shù)　選殖的概念　選殖研究的歷史　動(dòng)物選殖技術(shù)　選殖研究的現(xiàn)狀　選殖展望,3-1　細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能,細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞(cell)是由膜包圍著含有細(xì)胞核（或擬核）的原生質(zhì)所組成，是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，也是生命活動(dòng)的基本單位。細(xì)胞能夠透過(guò)分裂而增殖，是生物體個(gè)體發(fā)育和

2、系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)。細(xì)胞是遺傳的基本單位，具有遺傳的全能性。,,,細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)1665年，英國(guó)物理學(xué)家羅伯特?虎克(Robert Hooke, 1635~1703)用自己設(shè)計(jì)製造的顯微鏡觀察櫟樹(shù)軟木塞切片時(shí)發(fā)現(xiàn)其中有許多小室，狀如蜂窩，稱為「cella」，這是人類(lèi)第一次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞，生物學(xué)家就用「cell」一詞來(lái)描述生物體的基本結(jié)構(gòu)。1674年，荷蘭布商列文?霍克(Antonie van Leeuwenhoek, 1632~1723)為了檢查

3、布的質(zhì)量，親自磨製透鏡，裝配了高倍顯微鏡（300倍左右），並觀察到了血細(xì)胞、池塘水滴中的原生動(dòng)物、人類(lèi)和哺乳類(lèi)動(dòng)物的精子，這是人類(lèi)第一次觀察到完整的活細(xì)胞。,,,細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立1838~1839年間由德國(guó)的植物學(xué)家許萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺的研究報(bào)告，使得細(xì)胞及其功能有了較為明確的定義，宣告了細(xì)胞學(xué)說(shuō)基本原則的創(chuàng)立，細(xì)胞學(xué)說(shuō)直到1858年才完善。主要內(nèi)容細(xì)胞是有機(jī)體，一切動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，即生物是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物組成。所有細(xì)

4、胞在結(jié)構(gòu)和組成上基本相似。生物體是透過(guò)其細(xì)胞的活動(dòng)反映其功能。新細(xì)胞是由已存在的細(xì)胞分裂而來(lái)。生物的疾病是因?yàn)槠浼?xì)胞機(jī)能失常。,,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能生物的一個(gè)基本特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一。細(xì)胞是生物的基本結(jié)構(gòu)單位，可以分為原核細(xì)胞(prokaryotic cell)與真核細(xì)胞(eukaryotic cell)兩大類(lèi)。原核細(xì)胞沒(méi)有典型的核結(jié)構(gòu)，遺傳訊息的載體僅為一個(gè)裸露在細(xì)胞中的環(huán)狀DNA。真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)複雜，植物和動(dòng)物的細(xì)胞大

5、多都是真核細(xì)胞，如圖3.3所示。,,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能,,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞,,原核細(xì)胞地球上約3/4的生命物質(zhì)由微生物組成，而其中大多數(shù)是原核生物。原核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及遺傳訊息的複製和傳遞相對(duì)簡(jiǎn)單，即無(wú)性繁殖方式：先生長(zhǎng)成兩倍體，再分裂成兩個(gè)相同的子細(xì)胞，每個(gè)子細(xì)胞獲得它們上一代遺傳物質(zhì)的一個(gè)拷貝。原核細(xì)胞繁殖迅速，因此可作為良好的實(shí)驗(yàn)材料。,,原核細(xì)胞在所有的原核細(xì)胞中，大腸桿菌是被人們研究和了解得最多的一種。大腸桿菌的細(xì)胞膜

6、內(nèi)包裹著細(xì)胞質(zhì)以及核，由於核外無(wú)核膜，故也稱為核質(zhì)或擬核。核由一條環(huán)狀的雙股DNA組成，也稱為染色體DNA。除了染色體DNA外，大腸桿菌和許多細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中還含有稱為質(zhì)體的很小的環(huán)狀DNA。質(zhì)體在當(dāng)今遺傳工程中作用十分重要。,,真核細(xì)胞動(dòng)物、植物和真菌都是真核細(xì)胞構(gòu)成的生物，簡(jiǎn)稱真核生物。真核細(xì)胞區(qū)別於原核細(xì)胞的最主要特徵是它們具有被雙層膜所包裹的、有固定形狀的、結(jié)構(gòu)複雜的細(xì)胞核。,,細(xì)胞核與遺傳訊息細(xì)胞核(nucleus)是真

7、核細(xì)胞內(nèi)最大、最重要的胞器，大多呈球形或卵圓形。雙層核被膜(nuclear envelope)將核質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)分開(kāi)，遺傳訊息被保護(hù)在細(xì)胞核裏。核膜上有結(jié)構(gòu)複雜精細(xì)的核孔，是核內(nèi)外物質(zhì)與訊息交換的通道。一般說(shuō)來(lái)，真核細(xì)胞失去細(xì)胞核將導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。細(xì)胞核含有染色質(zhì)(chromatin)，染色質(zhì)是由DNA和蛋白質(zhì)體成的細(xì)絲。DNA與組蛋白結(jié)合，形成核小體(necleosome)，核小體相連成念珠狀，直徑約為11nm。每6個(gè)核小體盤(pán)繞形成直

8、徑為30nm的螺旋管。由螺旋管形成DNA複製環(huán)，再形成超螺旋管，再結(jié)合許多非組蛋白，最終形成能在顯微鏡下觀察到的直徑約為400nm的染色體。,,,細(xì)胞核與遺傳訊息染色體只有在細(xì)胞分裂的中期才能看到，它有利於遺傳物質(zhì)均等地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。一個(gè)細(xì)胞核內(nèi)含有該物種的全套遺傳訊息。人類(lèi)基因體DNA由30億對(duì)鹼基組成，約3萬(wàn)多個(gè)基因，可記錄50億比特的訊息量，相當(dāng)於2,000萬(wàn)冊(cè)圖書(shū)的訊息量。DNA上的遺傳訊息透過(guò)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯型成蛋白質(zhì)

9、來(lái)控制遺傳表現(xiàn)型。核仁的大小、形狀和數(shù)目隨生物的種類(lèi)、細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞代謝狀態(tài)而變化。核仁是rRNA合成、加工和核糖體次單元的裝配場(chǎng)所。細(xì)胞核骨架由纖維蛋白構(gòu)成。DNA複製、基因表現(xiàn)、病毒複製、染色體構(gòu)建都是在特定的核骨架系統(tǒng)上進(jìn)行。,,胞　器核糖體(ribosome)是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。核糖體由兩個(gè)不同大小的次單元構(gòu)成。合成蛋白質(zhì)時(shí)，小次單元先與mRNA結(jié)合，大次單元再結(jié)合上去。兩個(gè)次單元之間有一「通道」，使mRNA透過(guò)

10、，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。很大一部分核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的表面，形成粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。,,胞　器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmie reticulum, ER)分佈在細(xì)胞質(zhì)中，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常分佈於細(xì)胞核周?chē)?，呈同心圓狀排列，參與蛋白質(zhì)的合成與運(yùn)輸。在合成分泌蛋白質(zhì)旺盛的細(xì)胞裏，如漿細(xì)胞和胰腺細(xì)胞內(nèi)粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)十分發(fā)達(dá)。光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多呈網(wǎng)狀分佈的小管，在一定部位與粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連接，參與脂肪、磷脂膽固醇、肝醣的合成和分解。,,胞　器高爾基體(Golgi

11、 body)它位於細(xì)胞核的附近，由膜圍成的扁平囊和大泡、小泡3種結(jié)構(gòu)組成的。這些大泡有的成為溶體，分佈於細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；有的作為分泌顆粒，逐漸移向細(xì)胞膜並與細(xì)胞膜融合，再將所含的內(nèi)容物排出細(xì)胞外。高爾基體的作用如同一座加工廠，可以加工、濃縮和運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)。,,胞　器溶體(lysosome)是一種泡狀結(jié)構(gòu)，外包一層膜，內(nèi)部含有各種水解酶，能分解各種生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)和多醣等，其特徵性酶是酸性磷酸酶。主要功能：消化吞入細(xì)胞內(nèi)

12、的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)菌、病毒?？蓪⑾岬臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)，供細(xì)胞生命活動(dòng)，殘?jiān)倥懦黾?xì)胞外，由此起到了營(yíng)養(yǎng)和防禦的作用。,,胞　器葉綠體(chloroplast)是植物細(xì)胞特有的胞器，能吸收、固定太陽(yáng)能，是生命的基礎(chǔ)，也是文明的基礎(chǔ)。光合作用在葉綠體內(nèi)進(jìn)行。粒線體(mitochondria)是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場(chǎng)所，有細(xì)胞「動(dòng)力工廠」之稱。,細(xì)胞骨架(cytoskeleton),細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)由微絲、微

13、管和中間絲構(gòu)成。細(xì)胞骨架的作用不僅在維持細(xì)胞形態(tài)中起作用，而且對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)也是不可缺少的。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、訊息傳遞、細(xì)胞分裂、基因表現(xiàn)、細(xì)胞分化、酶反應(yīng)等生命活動(dòng)都必須在細(xì)胞骨架的特定部位進(jìn)行。,,細(xì)胞骨架(cytoskeleton),微管(microtubule)是由微管蛋白組成的中空管狀結(jié)構(gòu)，直徑20~25nm。微管蛋白有α、β兩種不同的次單元，它們相間排列，構(gòu)成螺旋狀的結(jié)構(gòu)。微管是纖毛、鞭毛、神經(jīng)突起、

14、著絲粒、紡錘體的主要構(gòu)成成分。微管的功能是保持細(xì)胞形狀、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)取?細(xì)胞骨架(cytoskeleton),微絲(microfilament)又稱肌動(dòng)蛋白纖維，直徑5~6nm。和肌球蛋白、肌鈣蛋白和原肌球蛋白組成粗絲和細(xì)絲，構(gòu)成肌肉收縮系統(tǒng)。,細(xì)胞骨架(cytoskeleton),中間絲(intermediate filament)大小介於微管和微絲之間，直徑7~10nm，是由上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種富含硫的纖維狀

15、蛋白質(zhì)，極其堅(jiān)韌。是皮膚、生皮、毛髮、角、指甲、鱗片、羽毛等結(jié)構(gòu)的主要部分，也是脊椎動(dòng)物外皮和附屬物的重要成分。微樑(microtrabecular system)是一類(lèi)遍佈於細(xì)胞內(nèi)的直徑為2~3nm的細(xì)密的立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，能夠聯(lián)繫各個(gè)胞器，並且賦予細(xì)胞溶質(zhì)相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)剛性和組織性。,細(xì)胞學(xué)的研究方法,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.2μm，而電子顯微鏡可達(dá)0.2nm，圖3.7比較了不同細(xì)胞的大小與光學(xué)顯微鏡、電子顯

16、微鏡、掃描通道顯微鏡的分辨率範(fàn)圍。,細(xì)胞學(xué)的研究方法,光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通複式光學(xué)顯微鏡的組成光學(xué)放大系統(tǒng)，為兩組玻璃透鏡：目鏡與物鏡。照明系統(tǒng)：光源、折光鏡和聚光鏡，有時(shí)另加各種濾光片以控制光的波長(zhǎng)範(fàn)圍。機(jī)械和支架系統(tǒng)：主要是保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配製和靈活調(diào)控。,細(xì)胞學(xué)的研究方法,對(duì)任何顯微鏡來(lái)說(shuō)，最重要的性能參數(shù)是分辨率，而不是放大倍數(shù)。分辨率是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。這兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)之間的距離取決於光源波長(zhǎng)λ、物鏡鏡口角α（

17、標(biāo)本在光軸的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角）和介質(zhì)折射率n，它們之間的關(guān)係是： D＝0.61λ/(n?sin α/2),細(xì)胞學(xué)的研究方法,電子顯微鏡技術(shù),細(xì)胞學(xué)的研究方法,電子顯微鏡技術(shù),細(xì)胞學(xué)的研究方法,電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡的高分辨率主要是因?yàn)槭褂昧瞬ㄩL(zhǎng)比可見(jiàn)光短得多的電子束作為光源，波長(zhǎng)一般小於0.1nm。電子顯微鏡主要由電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)等組成（圖3.9, 3.10）。,細(xì)胞成分的分析方法,細(xì)胞成分

18、的分析方法,形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞成分分析相結(jié)合是當(dāng)代細(xì)胞生物學(xué)研究中常常採(cǎi)用的實(shí)驗(yàn)方法，也是揭示生物大分子在細(xì)胞內(nèi)相互關(guān)係及功能的有力工具。胞器與生物大分子及其複合物可透過(guò)超速離心技術(shù)分離，再分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究。測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多醣和脂質(zhì)等細(xì)胞成分，通常利用一些顯色劑與待檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)能夠特異性結(jié)合的特徵，透過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分佈和含量。例如福爾根(Feulgen)反應(yīng)可以特異顯示D

19、NA的分佈。,細(xì)胞成分的分析方法,1970年代以來(lái)，免疫學(xué)的迅速發(fā)展為細(xì)胞生物學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的手段，特別是在細(xì)胞內(nèi)特異蛋白的定位與定性方面，單株杭體與其他一些檢測(cè)手段相結(jié)合發(fā)揮了重要作用。免疫螢光與免疫電鏡已成為研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位的重要技術(shù)。免疫電鏡技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，如：蛋白分泌的研究，透過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；一些結(jié)構(gòu)蛋白的研究，包括膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。細(xì)胞內(nèi)特異核酸

20、（DNA或RNA）序列的定性與定位通常採(cǎi)用原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)。用標(biāo)記的核酸探針透過(guò)分子雜交方法，確定特殊核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法，稱為原位雜交。原位雜交技術(shù)在顯微與亞顯微水準(zhǔn)上的基因定位、特異mRNA表現(xiàn)等問(wèn)題的研究中起重要作用。,細(xì)胞成分的分析方法,放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離輻射對(duì)乳膠（含AgBr或AgCl）的感光作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究的

21、一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。,細(xì)胞成分的分析方法,研究DNA合成時(shí)通常是用氚(3H)標(biāo)記的胸腺嘧啶去氧核苷(3H-TdR)。研究RNA合成時(shí)是用氚標(biāo)記的脲嘧啶核苷(3H-U)（圖3.11）。在研究含硫蛋白分子代謝時(shí)，可用35S標(biāo)記的蛋胺酸和半胱胺酸，3H或14C標(biāo)記的蛋胺酸、白胺酸等也是常用於蛋白分子合成的前體。,細(xì)胞成分的分析方法,細(xì)胞化學(xué)的定量分析方法,細(xì)胞顯微分光光度術(shù)(microspectrophotometry)利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)

22、對(duì)特異光譜吸收的原理，用來(lái)測(cè)定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)含量的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。流式細(xì)胞儀(flow cytometry)可定量地測(cè)定某一細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞的數(shù)量，還可將某一特異染色的細(xì)胞從數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)胞群體中分離出來(lái)、將DNA含量不同的中期染色體分離出來(lái)，近年來(lái)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。,細(xì)胞學(xué)研究的思考,對(duì)細(xì)胞成分的了解，特別是數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因及其表現(xiàn)產(chǎn)物的功能

23、，以及它們?cè)诩?xì)胞代謝與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老、凋亡等生命活動(dòng)中的作用與調(diào)節(jié)機(jī)制，則更廣泛地需要生物化學(xué)分析與分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用—藉助於當(dāng)今迅速發(fā)展的功能基因體學(xué)(functional genomics)、蛋白質(zhì)體學(xué)(proteomics)及生物資訊學(xué)(bioinformatics)。,,3-2　細(xì)胞選殖技術(shù),選殖的概念「選殖」是clone的音譯，當(dāng)作名詞用時(shí)，它被譯為無(wú)性繁殖系，意為來(lái)源於單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖的細(xì)胞群體；當(dāng)作動(dòng)詞用時(shí)，它表

24、現(xiàn)的是形成無(wú)性繁殖系的過(guò)程或方法。選殖技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)中又被稱為「生物放大技術(shù)」，經(jīng)歷了3個(gè)發(fā)展時(shí)期微生物選殖，即用一個(gè)細(xì)菌複製出成千上萬(wàn)個(gè)和它一模一樣的細(xì)菌，成為一個(gè)細(xì)菌群。分子選殖，比如DNA的複製，得到大量相同的分子。動(dòng)物選殖技術(shù)。,動(dòng)物選殖技術(shù),胚胎分割用機(jī)械方法把已發(fā)育的胚胎分割，再把每一部分移植到動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)發(fā)育後出生。該法可以提高動(dòng)物生產(chǎn)效率，但這並不是嚴(yán)格意義上的選殖。胚胎細(xì)胞核移植它是用顯微手術(shù)的方法將未

25、著床的早期胚胎細(xì)胞分離成單個(gè)卵裂球，再把單個(gè)卵裂球細(xì)胞導(dǎo)入去除染色體的卵母細(xì)胞中，經(jīng)一系列的步驟獲得胚胎，經(jīng)移植後獲得後代。,動(dòng)物選殖技術(shù),胚胎幹細(xì)胞核移植胚胎幹細(xì)胞是一種全能細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)條件下使細(xì)胞數(shù)量倍增，而細(xì)胞不分化，每個(gè)細(xì)胞仍具有發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體的能力，把這種細(xì)胞用以上核移植技術(shù)導(dǎo)入除去染色體的成熟的卵母細(xì)胞內(nèi)，得到選殖胚胎，經(jīng)移植至動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生後代動(dòng)物。體細(xì)胞核移植用動(dòng)物體細(xì)胞作細(xì)胞核來(lái)源，用核移植的方法將其導(dǎo)入

26、去核卵母細(xì)胞，得到選殖胚胎，移植產(chǎn)仔，獲得體細(xì)胞選殖動(dòng)物。,哺乳動(dòng)物選殖技術(shù),要完成「哺乳動(dòng)物選殖技術(shù)」必須包括設(shè)備齊全的細(xì)胞和胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代、篩選和胚胎的重建工作。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，提供供體動(dòng)物或供體卵母細(xì)胞，也能提供受體動(dòng)物，使重建的胚胎得到正常的發(fā)育。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行外源基因操作的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。,哺乳動(dòng)物選殖技術(shù),哺乳動(dòng)物選殖技術(shù),選殖實(shí)驗(yàn)室需要的材料主要是卵母細(xì)胞和供核細(xì)胞。卵母細(xì)胞的來(lái)源：一種是處?kù)对似?/p>

27、的受精卵；另一種是成熟的卵母細(xì)胞。核供體細(xì)胞的來(lái)源：最早進(jìn)行哺乳動(dòng)物核移植是使用早期胚胎卵裂球，從1986年開(kāi)始使用，迄今仍然是核供體的主要來(lái)源。哺乳動(dòng)物的核移植：卵母細(xì)胞的去核→供體的準(zhǔn)備→核移植→融合和活化→重構(gòu)選殖胚胎的發(fā)育,胚胎分割,可把它作為選殖技術(shù)的一種。它可用來(lái)提高優(yōu)質(zhì)胚胎的利用效率，促進(jìn)良種的推廣，在畜牧生產(chǎn)良種群的擴(kuò)繁上有一定意義。胚胎分割方法始於1970年，用於小鼠，後來(lái)在兔、山羊、綿羊、奶牛、猿均獲得成功，已

28、經(jīng)是比較成熟的技術(shù)。2000年1月schattell等人將此技術(shù)用於靈長(zhǎng)目動(dòng)物，獲得了經(jīng)胚胎分割的恆河猴Tetra，見(jiàn)圖3.14。這是第一隻經(jīng)胚胎分割產(chǎn)生的恆河猴，為了說(shuō)明它是四分胚的後代而取名為T(mén)etra，即四的意思。操作過(guò)程見(jiàn)圖3.15。,胚胎分割,胚胎分割,胚胎細(xì)胞選殖,如果核移植所用的核供體來(lái)自胚胎的卵裂球，則稱為胚胎細(xì)胞選殖。,胚胎幹細(xì)胞選殖,胚胎幹細(xì)胞（ES細(xì)胞）具有發(fā)育的全能性，有與早期胚胎相似的分化能力和正常的二倍體染

29、色體核型。ES細(xì)胞除了用於基因打靶外，還可以用到核移植中。由於它能建系、傳代培養(yǎng)，也可以冷凍保存，因此它可以為核移植提供源源不斷的核供體。,胚胎幹細(xì)胞選殖,核移植按檀香山技術(shù)（圖3.17）進(jìn)行小鼠卵母細(xì)胞用作受體。ES細(xì)胞按大小分為兩組，小細(xì)胞組直徑為10μm，大細(xì)胞組平均直徑為18μm，小細(xì)胞組用細(xì)顯微注射針（內(nèi)徑6μm），大細(xì)胞用較粗的顯微注射針（內(nèi)徑10μm）進(jìn)行操作。採(cǎi)用多次吸入吹出法，使細(xì)胞膜破裂以分離出細(xì)胞核。注射在

30、室溫進(jìn)行(25~29℃)，重構(gòu)胚放在CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)育後移至同期發(fā)情母鼠。Wakayama等人1999年12月用胚胎幹細(xì)胞核移植方法，成功的獲得了複製鼠後代。,,胎兒成纖維細(xì)胞核移植,動(dòng)物胎兒細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使分散為單個(gè)細(xì)胞。再經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，便可用於核移植的核供體。許多學(xué)者均用這種方法成功地獲得了複製動(dòng)物，如綿羊、山羊、牛和豬，是一個(gè)較好的核體來(lái)源。,成體細(xì)胞選殖,「桃莉」的選殖英國(guó)科學(xué)家將來(lái)自蘇格蘭黑面羊的

31、卵母細(xì)胞去核處理，卵母細(xì)胞具有由蛋白質(zhì)和纖維組成的外殼的透明帶(Zona pellucida)，它是一層保護(hù)膜。將純白色毛皮芬蘭陶賽特綿羊處?kù)鹅o止期(G0)的乳腺細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞放在一起，然後用微弱的電脈衝以促使供核細(xì)胞與去核的細(xì)胞質(zhì)融合。電脈衝也促使細(xì)胞活化，並開(kāi)始分裂。新的融合細(xì)胞移植到黑面羊的生殖腔，148天之後（1997年2月），一隻正常出生、體重6.6kg的芬蘭陶賽特細(xì)毛純白色複製小羊—「桃莉」誕生了。,成體細(xì)胞選殖,

32、成體細(xì)胞選殖,檀香山技術(shù)（見(jiàn)圖3.17）檀香山技術(shù)與複製「桃莉」不同之處如下：使用卵丘細(xì)胞，這是一種分化的體細(xì)胞且數(shù)量眾多，容易獲得。採(cǎi)用了將核直接注射入去核卵母細(xì)胞的方法。卵母細(xì)胞的活化採(cǎi)用化學(xué)方法，即用鍶離子進(jìn)行處理，而沒(méi)有採(cǎi)用電脈衝活化法，省去了相應(yīng)的儀器。成活動(dòng)物與移植胚數(shù)量之比有所提高，達(dá)到了2.35%。,成體細(xì)胞選殖,基因轉(zhuǎn)殖選殖技術(shù)將外源DNA注射到受精卵的原核，再移植到受體動(dòng)物，待出生後檢測(cè)後代是否含有外源基

33、因。由於基因是透過(guò)隨機(jī)整合進(jìn)入受精卵的，因此整合率很低，一般只有15%左右，而且需要數(shù)量較多的受體動(dòng)物，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物生產(chǎn)成本極高，也制約了這一技術(shù)的發(fā)展。,成體細(xì)胞選殖,基因打靶基因轉(zhuǎn)殖選殖技術(shù)利用基因打靶技術(shù)，把外源基因定點(diǎn)插入體細(xì)胞中，再經(jīng)核移植技術(shù)得到帶有外源基因的選殖動(dòng)物的技術(shù)。它是在體細(xì)胞選殖技術(shù)、體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)殖選殖技術(shù)之後發(fā)展起來(lái)的第三個(gè)重大技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景。異種動(dòng)物選殖上面所講的選殖技術(shù)，包括體細(xì)胞選殖

34、產(chǎn)生的「桃莉」、小鼠、牛均是使用來(lái)自同一種動(dòng)物的供體和受體細(xì)胞，而且必須移植到同種動(dòng)物子宮內(nèi)，經(jīng)發(fā)育產(chǎn)出複製動(dòng)物。但這種選殖方法卻不適用於珍稀瀕危動(dòng)物，例如大熊貓。,選殖研究的現(xiàn)狀,選殖之所以獲得成功是因?yàn)榕咛ゼ?xì)胞具有全能性，它的細(xì)胞核帶有全部遺傳物質(zhì)，在被移植到卵母細(xì)胞後能發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體。「桃莉」的誕生激勵(lì)各國(guó)科學(xué)家進(jìn)一步深入研究哺乳動(dòng)物的選殖問(wèn)題。1998年5月美國(guó)Wakayama等在Nature雜誌上報(bào)導(dǎo)，他們用小鼠卵丘

35、細(xì)胞作核供體，在選殖桃莉羊技術(shù)基礎(chǔ)上，對(duì)Wilmut的方法進(jìn)行了改進(jìn)。他們的技術(shù)使選殖的效率有所提高，其成功率達(dá)到2%（而桃莉羊的成功率僅為1/277），被稱為「檀香山技術(shù)」。,選殖研究的現(xiàn)狀,1998年是複製動(dòng)物大豐收的一年。3月，法國(guó)Renard等人用牛胎兒肌細(xì)胞獲得複製?！格R格麗特」。4月，紐西蘭Wells等人用牛胎兒成纖維細(xì)胞獲得複製?！讣?。同時(shí)日本Izumi等用輸卵管上皮細(xì)胞獲複製牛。10月，中國(guó)杜淼等用羊胎兒成纖維細(xì)胞獲

36、選殖山羊。2001年，美國(guó)Hill等人用牛胎兒成纖維細(xì)胞獲複製牛；Yukiko等用分裂中期胚胎成纖維細(xì)胞獲選殖小鼠。與此同時(shí)利用選殖技術(shù)和基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)、基因打靶技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物也取得了較大的進(jìn)展。1997年8月，Schnieke等人獲轉(zhuǎn)人基因羊Polly；12月，Angelika等用基因轉(zhuǎn)染羊胎成纖維細(xì)胞，再經(jīng)核移植獲得人FIX基因轉(zhuǎn)殖羊。,選殖研究的現(xiàn)狀,特別要提及的是，在進(jìn)行各種動(dòng)物體細(xì)胞選殖的同時(shí)，異種動(dòng)物選殖也在悄

37、然興起。動(dòng)物研究所陳大元領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從1998年開(kāi)始對(duì)大熊貓選殖進(jìn)行了研究，並證明了大熊貓核供體細(xì)胞在兔卵胞質(zhì)中可去分化而支持早期重構(gòu)胚發(fā)育。體細(xì)胞選殖技術(shù)逐漸走向完善，並與其他各種技術(shù)（如基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)、基因打靶技術(shù)）互相結(jié)合得到具有新特性的動(dòng)物，更好地滿足人類(lèi)社會(huì)的需要。同時(shí)，選殖技術(shù)存在的各種問(wèn)題，也促使科學(xué)家去深入探索，使這一技術(shù)更加完善。,選殖展望,現(xiàn)在的選殖技術(shù)仍然是一個(gè)技巧性很強(qiáng)、操作性很細(xì)的技術(shù)，而且都是手工操作。每一