復(fù)旦生物制藥的講義發(fā)酵罐及滅菌方法

1、第三節(jié) 發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌,,典型發(fā)酵設(shè)備,種子制備設(shè)備、主發(fā)酵設(shè)備、輔助設(shè)備(無菌空氣和培養(yǎng)基的制備)，發(fā)酵液預(yù)處理設(shè)備，粗產(chǎn)品的提取設(shè)備、產(chǎn)品精制與干燥設(shè)備、流出物回收、利用和處理設(shè)備等。,一 發(fā)酵設(shè)備概述,發(fā)酵主要設(shè)備為發(fā)酵罐和種子罐，它們各自都附有原料(培養(yǎng)基)調(diào)制、蒸煮、滅菌和冷卻設(shè)備，通氣調(diào)節(jié)和除菌設(shè)備，以及攪拌器等。 種子罐：以確保發(fā)酵罐培養(yǎng)所必需的菌體量為目的。發(fā)酵罐：承擔(dān)產(chǎn)物的生產(chǎn)任務(wù)。它必須能夠提供微生物生

2、命活動和代謝所要求的條件，并便于操作和控制，保證工藝條件的實現(xiàn)，從而獲得高產(chǎn)。,(一)發(fā)酵罐,發(fā)酵罐的定義：是為一個特定生物化學(xué)過程的操作提供良好而滿意的環(huán)境的容器。對于某些工藝來說，發(fā)酵罐是個密閉容器，同時附帶精密控制系統(tǒng)；而對于另一些簡單的工藝來說，發(fā)酵罐只是個開口容器，有時甚至簡單到只要有一個開口的坑。,發(fā)酵罐系統(tǒng),一個優(yōu)良的發(fā)酵罐裝置和組成（1）應(yīng)具有嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)（2）良好的液體混合特性（3）好的傳質(zhì)、傳熱速率（4）具有配

3、套而又可靠的檢測、控制儀表,發(fā)酵罐的特點,（1）發(fā)酵罐對純種培養(yǎng)的要求高。因此，發(fā)酵罐的嚴(yán)密性，運行的高度可靠性是發(fā)酵工業(yè)的顯著特點。（2）發(fā)酵罐更加趨向大型化和自動化發(fā)展。 自動化方面，如pH電極、溶解氧電極、溶解二氧化碳電極等的在線檢測在國外巳相當(dāng)成熟。國內(nèi)目前尚處于起步階段，發(fā)酵檢測參數(shù)還只限于溫度、壓力、空氣流量等一些最常規(guī)的參數(shù)。,發(fā)酵罐基本類型,(1）攪拌釜反應(yīng)器（stirred tank reactor）(2）氣

4、泡柱式反應(yīng)器（bubble column)(3) 氣升式生物反應(yīng)器 （airlift reactor) 內(nèi)管型；外管型,發(fā)酵罐工藝操作條件,1．溫度：25～40℃。2．壓力：0～1 kg／cm3(表壓)。3．滅菌條件；溫度100～140℃，壓力0～3 kg／cm3 (表壓).4．pH：2～11。5．需氧量：0．05～0.3 kmo1／m3·h。6．通氣量：0.3～2 VVM。

5、7．功率消耗：0.5～4kW／m3。8. 發(fā)酵熱量：5 000～20 000 kcal／m3．h。,發(fā)酵設(shè)備及檢測控制系統(tǒng)?? B|Braun公司,,發(fā)酵罐：Biostat系列參數(shù)檢測多級控制：,Biostat B2,Biostat ED10,Pilot Biostat UD50,國內(nèi)、外發(fā)酵設(shè)備公司,德國貝朗 占中國80%以上的市場瑞士比歐美國NBS韓國日本華東理工大學(xué)江蘇理工大學(xué),一般認為500L以

6、下的是實驗室發(fā)酵罐；500-5000L是中試發(fā)酵罐；5000L以上是生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵罐。,發(fā)酵罐按容積分類,現(xiàn)代發(fā)酵工程規(guī)模,低值工業(yè)品大型化 以規(guī)模來取勝（幾十?dāng)?shù)百噸）。如味精、氨基酸、有機酸、抗生素、飼料、食品工業(yè)用產(chǎn)品等；高價值轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品小型化（幾十?dāng)?shù)百升）?；蚬こ檀竽c桿菌、酵母菌高密度培養(yǎng)；動物細胞植物細胞培養(yǎng)；研究中心智能化、全能性。,(二)發(fā)酵輔助設(shè)備,發(fā)酵輔助設(shè)備主要包括：無菌空氣系統(tǒng)，培養(yǎng)基配制和滅菌系統(tǒng)、發(fā)酵

7、車間的管道及閥門等。,1、無菌空氣系統(tǒng),好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣，空氣要作到 絕對無菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟的。發(fā)酵對無菌空氣的要求是 ：無菌，無灰塵，無雜質(zhì)，無水，無油，正壓等幾項指標(biāo)；發(fā)酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設(shè)計中一般要求1000次使用周期中只允許有一個菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3,發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程,高空取氣管,高

8、空取氣管是遠離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的 微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據(jù)資料介紹，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個數(shù)量級，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。,油水分離器,其內(nèi)部同時采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴散及凝聚等機理，能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃，內(nèi)部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長。,兩級分離、冷卻、加熱的空氣除菌流程,１——粗過濾器　２——壓縮機　 ?。场A罐４——冷卻器

9、５——絲網(wǎng)分離器　 ６——過濾器,高效前置過濾除菌流程,１——高效前置過濾器?。病獕嚎s機?。场A罐?。础鋮s器　 ５——絲網(wǎng)分離器　　６——加熱器?。贰^濾器,空氣凈化的流程,吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾進入空氣壓縮機（120-150度）冷卻（20-25度），除去油、水，再加熱至30-35度。最后通過總過濾器和分過濾器除菌，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。,空氣壓縮機：目前常用的是往復(fù)式空壓機

10、過濾器：空氣過濾器的類型很多，有棉花活性炭過濾器、管式過濾器和接送式過濾器等。過濾介質(zhì)：空氣除菌用的過濾介質(zhì)有：棉花、活性炭玻璃纖維，超細玻璃纖維紙，石棉濾板、燒結(jié)材料、聚乙烯醇(PVA)等多孔合成樹脂、素?zé)沾赏埠途厶妓狨サ取?培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（culture medium)是人工配制的適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。碳源氮源無機鹽及微量元素前體、促進劑與抑制劑,培養(yǎng)基的類型,孢子培養(yǎng)基：供菌種繁殖孢子，

11、常用固體培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：提供大量優(yōu)質(zhì)的菌體，其配方上應(yīng)適合于菌體生長于繁殖發(fā)酵培養(yǎng)基：使微生物積累代謝產(chǎn)物，既要有利于生長繁殖，防止菌體過早衰老，又要有利于產(chǎn)物的大量合成。,2、培養(yǎng)基的滅菌,1）空罐滅菌 空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進罐前對罐進行預(yù)先滅菌，為空罐滅菌。為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時間較長，只有這樣才能殺死設(shè)備中

12、各死角殘存的雜菌或芽孢。,,2）實罐滅菌 將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱，達到預(yù)定滅菌溫度后，維持一定時間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種發(fā)酵，這叫做實罐滅菌，又稱分批滅菌。 操作要點： 三路進汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時間。這就是所謂的“三路進氣”。,3）連消,加熱設(shè)備：在配料罐里培養(yǎng)基被加熱到70℃，然后，用泵送到加熱設(shè)備，在20秒的時間內(nèi)繼續(xù)加熱到130～140℃。常用的加熱

13、設(shè)備有塔式和噴射式兩種。塔式加熱設(shè)備又稱連消塔，塔的有效高度2～3m，料液在塔中的流速是0.1m／s，因此料液在塔內(nèi)的滯留時間為2～30s。噴射式加熱器有一噴嘴，蒸汽由噴嘴噴出，料液從側(cè)面進入加熱器而被蒸汽加熱。,,℃,維持設(shè)備維持設(shè)備使加熱后的培養(yǎng)基保溫—定的時間，從而達到滅菌的目的。維持設(shè)備有兩種：罐式和管式。罐式的是一個帶有上下開口用于進出料的立式密封容器；管式的是用無縫鋼管焊成，管內(nèi)流速可取0.3～0.6m／s。,冷卻

14、設(shè)備 ①噴淋冷卻器 ②套管冷卻器 ③板式換熱器 ④螺旋板換熱器,4）影響培養(yǎng)基滅菌的因素,pH值的影響 pH值對微生物的耐熱性影響很大，pH為6.0~8.0時微生物最不易死亡， pH <6.0時氫離子易滲入微生物的細胞內(nèi)。,,培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的成分中，油脂、糖類、蛋白質(zhì)都是傳熱的不良介質(zhì)，會增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。濃度較高的培養(yǎng)基相對需要較高溫度和較長時間滅菌。高濃度的鹽類，色素

15、則削弱其耐熱性，故較易滅菌。,,培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì) 培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說來，含有顆粒對培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，特別是存在凝結(jié)成團的膠體時，會影響滅菌效果，必須過濾除去。,5）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止,消除高溫有害影響的措施,（1）采用特殊加熱滅菌法 （2）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進行滅菌時，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（3）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽

16、先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（4）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進行低壓滅菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；（5）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進行培養(yǎng)基的滅菌,3、管道及閥門,管道 ：與發(fā)酵罐連接的管道有水管、料管、空氣管和蒸汽管; 發(fā)酵罐內(nèi)的冷卻蛇管與發(fā)酵罐內(nèi)直接相連的料管等，最好采用不銹鋼管。管徑選取的流速是：上水管1～2m／s；

17、料管0.5～1.0m／s；空氣管10～15m／s；蒸汽15～20m／s。,閥門：閥門是發(fā)酵罐的重要組成，它被用于調(diào)節(jié)控制氣體和液體的流量。閥門的選取應(yīng)考慮：①用于什么目的；②閥門的材料是否耐溫、耐壓等；③連接方式；④經(jīng)濟成本；⑤操作方式。,第二部分：消毒與滅菌,消毒(disinfection)：殺死物體上病原微生物的方法，并不一定能殺死含芽胞的細菌或非病原微生物。用以消毒的藥品稱為消毒劑(disinfectant)。滅菌(

18、sterilization)：殺滅物體上所有微生物的方法。滅菌比消毒要求高，包括殺滅細菌芽胞在內(nèi)的全部病原微生物和非病原微生物。抑菌(bacteriostasis)：抑制體內(nèi)或體外細菌的生長繁殖。常用的抑菌劑為各種抗生素。防腐(antisepsis)：防止或抑制體外細菌生長繁殖的方法。細菌一般不死亡。無菌(asepsis)：不存在活菌。,熱力滅菌法輻射殺菌法濾過除菌法超聲波殺菌法干燥與低溫抑菌法,第一節(jié) 物理消毒滅菌法,

19、干熱滅菌法— 焚燒：廢棄物、尸體 灼燒：接種環(huán)、試管口 干烤：玻璃器皿 紅外線：醫(yī)療器械濕熱滅菌法（moist heat sterilization)— 巴氏消毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒。 煮沸法；流動蒸汽消

20、毒法 間歇蒸汽消毒法； 高壓蒸汽滅菌法,一. 熱力滅菌法,紫外線 波長200-300nm的紫外線具有殺菌作用。 其主要作用于DNA，使一條DNA鏈上相鄰的兩個胸腺嘧 啶共價結(jié)合形成二聚體，導(dǎo)致細菌變異和死亡。電離輻射 高速電子、X射線、γ射線微波 波長1mm~1m,二. 輻射殺菌法,賽氏濾器玻璃濾器薄膜濾器,三. 濾過除菌法,是一種機械的作用因素

21、，每秒超過2萬次振動的聲波即為超聲波。常用的超聲波發(fā)生器能產(chǎn)生20-100千赫的聲波，可使細菌細胞壁裂解而死亡。,四. 超聲波殺菌法,干燥法 低溫法：低溫可使細菌的新陳代謝減慢，常用作保存細菌菌種。冷凍真空干燥法是目前保存菌種的最好方法。,五. 干燥低溫抑菌法,消毒劑的種類：酚類、醇類、重金屬鹽類、氧化劑、表面活性劑、烷化劑。消毒劑的應(yīng)用：病人排泄物與分泌物、皮膚、粘膜、飲水、廁所、空氣、手。,第二節(jié) 化學(xué)消毒滅菌法,消毒劑的

22、性質(zhì)、濃度與作用時間微生物的種類與數(shù)量溫度酸堿度有機物,第三節(jié) 影響消毒滅菌效果的因素,人有了知識，就會具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說“書中自有黃金屋?！蓖ㄟ^閱讀科技書籍，我們能豐富知識，培養(yǎng)邏輯思維能力；通過閱讀文學(xué)作品，我們能提高文學(xué)鑒賞水平，培養(yǎng)文學(xué)情趣；通過閱讀報刊，我們能增長見識，擴大自己的知識面。有許多書籍還能培養(yǎng)我們的道德情操，給我們巨大的精神力量，鼓