生物科學(xué)畢業(yè)論文黃海葵毒素的分離純化與鑒定

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　黃?？舅氐姆蛛x純化與鑒定</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 生物科學(xué)

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></

3、p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1 材料與方法3</b></p><p><b>　　1.1材料3</b>

4、;</p><p>　　1.1.1實(shí)驗(yàn)材料3</p><p>　　1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器3</p><p>　　1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑3</p><p><b>　　1.2方法3</b></p><p>　　1.2.1?？侄镜奶崛?</p><p>　　1.2.2?？?/p>

5、素的分離4</p><p>　　1.2.3 毒素多肽的用Tris-Tricine SDS-PAGE電泳7</p><p>　　1.2.4通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)毒素多肽進(jìn)行初步的鑒定9</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果10</b></p><p>　　2.1?？舅亟?jīng)Sepax-100A色譜柱第一次分離10<

6、;/p><p>　　2.2 海葵毒素經(jīng)C8半制備型反相HPLC第二次分離11</p><p>　　2.3?？舅亟?jīng)分析型C18反相柱第三次分離13</p><p>　　2.4對(duì)分離后的?？舅刭|(zhì)譜分析14</p><p><b>　　討論16</b></p><p><b>　　參考

7、文獻(xiàn)18</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要]：黃海葵（AnthopLeura xanthogrammica）是舟山海域中常見(jiàn)的一種小型?？渖眢w以及觸手中都含有刺細(xì)胞，刺細(xì)胞中含有?？舅豙1]。?？亲饔糜陔x子通道的縮氨酸毒素的豐富來(lái)源，

8、兩類(lèi)縮氨酸毒素：一類(lèi)是site-3鈉通道毒素；另一類(lèi)是Kv1鉀通道毒素，其特性已被很好的表現(xiàn)，它們中的一部分被用于有價(jià)值的藥理學(xué)試劑[2]。由于?？N類(lèi)繁多、分布較廣，使得很多海葵毒素未得到研究，極大一部分的?？舅氐慕Y(jié)構(gòu)與功能都尚不清楚。我們本實(shí)驗(yàn)通過(guò)反復(fù)凍融提取?？侄?，并利用多維高效液相色譜對(duì)?？舅剡M(jìn)行分離，同時(shí)在動(dòng)物體上進(jìn)行殺蟲(chóng)活性分析等方法，從黃?？侄局泻Y選出七種具有較強(qiáng)殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)肽。這七種多肽在100μg/kg體重濃

9、度下對(duì)水白蝦以及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)都具有強(qiáng)且快速的麻痹及很強(qiáng)的致死活性，但其多肽在相同體重濃度下的相對(duì)于小白鼠而言毒性作用很弱。通過(guò)質(zhì)譜分析，得到的七種殺蟲(chóng)多肽的分子量約在2~5kDa之間，其中分子量為5018kDa的殺蟲(chóng)多肽質(zhì)譜得到的氨基酸序列為GGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGIIWLRGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ。上述研究結(jié)果表明</p><p>　　[關(guān)鍵詞]：黃?？?；?？舅?；殺蟲(chóng)肽；高

10、效液相色譜；質(zhì)譜分析；</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract]: AnthopLeura xanthogrammica is a commonly small sea anemones in zhoushan waters. its body and tentacles contain the stinging

11、cell .it contains the sea anemone toxins [1]. The sea anemone is the resource of peptide toxins which work in ion channel. two kinds of peptide toxins: one kind is site - 3 sodium channel toxins; Another kind is Kv1 pota

12、ssium channel toxins, its character has been perfectly performed. Which of them could be as to valuable pharmacological reagents[2]. Because of </p><p>　　[Keyword] AnthopLeura xanthogrammica; sea anemone tox

13、ins; Insecticidal peptide; High performance liquid chromatography (HPLC); Mass spectrometry</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　節(jié)肢動(dòng)物害蟲(chóng)分布于世界的各個(gè)角落，破壞了世界上20-40%的農(nóng)作物[3]。多年來(lái)，我國(guó)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，不僅造

14、成環(huán)境污染，而且引發(fā)害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性和農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)等嚴(yán)重問(wèn)題。如今世界許多國(guó)家從蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒、海洋和植物等天然生物資源中篩分和鑒定各種有效生理活性成分，并利用這些天然神經(jīng)生物毒素構(gòu)建新型的生物殺蟲(chóng)劑和抗病蟲(chóng)害植物體系。其中，?？舅赜捎谄渲饕饔脤?duì)象為甲殼類(lèi)動(dòng)物因而在生物毒素來(lái)源的殺蟲(chóng)劑開(kāi)發(fā)中受到重視。</p><p>　　海葵又名海菊花、海淀根，屬于腔腸動(dòng)物門(mén)（又名刺細(xì)胞動(dòng)物門(mén)），珊瑚蟲(chóng)綱、六放珊瑚亞

15、綱海洋獨(dú)居動(dòng)物，六放珊瑚亞綱下有3 個(gè)目, 包括海葵目、群體海葵目和角?？縖5]。?？挠|手及身體均含有大量的刺細(xì)胞,通過(guò)刺細(xì)胞，分泌毒液捕食魚(yú)、貝類(lèi)、橈足類(lèi)、甲殼類(lèi)動(dòng)物等。當(dāng)?？艿酵饨鐧C(jī)械或化學(xué)刺激時(shí), 會(huì)釋放刺絲刺入獵物身體并將毒素注入獵物體內(nèi), 以此達(dá)到捕食或防御的目的。?？N類(lèi)繁多,目前有報(bào)道的已超過(guò)1 000 種, 廣泛分布于世界各海區(qū), 中國(guó)?？贩N約占世界的1/10。</p><p>　　對(duì)?？?/p>

16、毒素多肽的研究自20世紀(jì)70年代開(kāi)始，目前已經(jīng)從約40 種?？蟹蛛x到超過(guò)300種毒素多肽分子，包括Nav通道，鉀離子通道毒素，酸感受離子通道，穿孔素，蛋白酶抑制劑等。根據(jù)分子量以及生物學(xué)功能的不同, 可以分為海葵溶細(xì)胞毒素以及?？嚯念?lèi)神經(jīng)毒素兩大類(lèi)[6]。?？舅刂杂绊戨妷洪T(mén)離子通道，是因?yàn)槠渥饔脤?duì)象無(wú)論是脊椎還是無(wú)脊椎動(dòng)物，大部分都通過(guò)動(dòng)作電位完成信號(hào)傳導(dǎo)的。有一些?？麑?duì)人都是很危險(xiǎn)的，但大多數(shù)情況下，只是發(fā)炎或輕微疼痛。Ac

17、tinoporins對(duì)魚(yú)和甲殼動(dòng)物這類(lèi)天然食物毒性非常高，即使是釋放在水中，毒性也相當(dāng)高。</p><p>　　?？浲ǖ蓝舅匾延惺喾N被分離到，根據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同可將其分為三類(lèi)，分別為1型，2型和3型。1型鉀通道毒素主要包括來(lái)自列指?？腟hK[8]、溝迎風(fēng)?？腁sKS[9]、?？腂gK[10]、公主?？腍mK[11]、Actinia equina的AeK[12]等。最近又從?？蟹蛛x到一種新的1型鉀通

18、道毒素，命名為AETX K，這是目前發(fā)現(xiàn)的第六種1型鉀通道毒素[13]。1型鉀通道毒素由35-37個(gè)氨基酸殘基組成，序列中含六個(gè)半胱氨酸并形成3對(duì)二硫鍵，其連接方式不同于海葵鈉通道毒素，為I-VI，II-IV和III-V。?？?型鉀通道毒素主要作用于Kv1鉀通道并阻斷鉀離子電流，且對(duì)Kv1鉀通道的阻斷作用非常強(qiáng)烈，例如，Kv1.1和Kv1.3鉀通道的半抑制濃度達(dá)皮摩爾水平，是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的Kv1鉀通道毒素之一，這對(duì)于Kv1鉀通道及

19、其相關(guān)疾病的研究具有重要意義[14]。此外，還被發(fā)現(xiàn)能強(qiáng)烈抑制Kv3.2鉀通道電流，其IC50為0.6 nM[15]。?？?型鉀通道毒素目前發(fā)現(xiàn)得還不多，從溝迎風(fēng)?？鸄nemonia sulcata中分離到三種鉀通道毒素，命名為AsKC-1，2和3，這三種</p><p>　　從?？羞€發(fā)現(xiàn)不少多肽毒素對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物具有特異的致死或麻痹作用，而對(duì)哺乳動(dòng)物沒(méi)有活性，該類(lèi)多肽毒素的作用靶點(diǎn)尚不清楚，但其對(duì)甲殼動(dòng)物所表現(xiàn)

20、出的選擇性毒理作用使其有望成為開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)肽的先導(dǎo)分子[20]。例如，來(lái)自?？腁ETX II和III[21],來(lái)自?？膅igantoxin I [22,23], 以及來(lái)自?？腁m I和II等[24]。上述?？舅鼐芴禺惖刈饔糜诩讱?dòng)物，使其麻痹或死亡，而對(duì)哺乳動(dòng)物沒(méi)有毒性。</p><p>　　?？舅刂杂绊戨妷洪T(mén)離子通道，是因?yàn)槠渥饔脤?duì)象無(wú)論是脊椎還是無(wú)脊椎動(dòng)物，大部分都通過(guò)動(dòng)作電位完成信號(hào)傳導(dǎo)的。從進(jìn)

21、化的角度看，?？募讱?dòng)物特異性毒素也許可以讓我們發(fā)掘到一些昆蟲(chóng)特異性毒素。鑒于節(jié)肢動(dòng)物與甲殼動(dòng)物存在進(jìn)化同源性，?？舅囟嚯膶?duì)昆蟲(chóng)也具有毒害作用，其中有很多是對(duì)昆蟲(chóng)有特異殺傷作用而對(duì)哺乳動(dòng)物低毒性的分子，因此，?？舅厥且粋€(gè)理想的殺蟲(chóng)肽存儲(chǔ)庫(kù)[25]。</p><p>　　黃?？ˋnthopLeura xanthogrammica）為?？苽?cè)花海葵屬，分布于我國(guó)東海沿岸以及日本沿海等，體壁呈暗綠色，表面有很多

22、縱行的疣突，體壁上有小孔，體內(nèi)的毒絲由小孔伸出孔外。在黃?？w內(nèi)觀察到3種刺細(xì)胞，由于所處的位置不同，3種刺細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能也不同。第1種為觸手上的刺絲囊，主要與捕食及運(yùn)動(dòng)有關(guān)，為黏性刺絲囊。第2種為隔膜絲上的刺細(xì)胞，刺針受到刺激后，刺絲囊才會(huì)放出刺絲。由此推測(cè)，內(nèi)部應(yīng)有卷纏刺絲囊，對(duì)進(jìn)入消化腔的食物進(jìn)行纏繞使其集中在腺體附近便于消化。第3種刺絲囊為穿刺刺絲囊，當(dāng)受刺激時(shí)，刺絲向外翻出，把毒素射入捕獲物體內(nèi)，將其麻痹或殺死。</p

23、><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1材料</b></p><p><b>　　1.1.1實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物是舟山海域的黃?？ˋnthopLeura xanthogrammica），于2010年4月初，

24、采自舟山市朱家尖某沿海海域，淺海巖石上。經(jīng)浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院趙盛龍教授鑒定, 所采集的樣品為黃海葵。</p><p>　　水白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名脊尾白蝦(Holthuis) 購(gòu)于舟山市定海區(qū)南珍菜場(chǎng)，購(gòu)買(mǎi)需符合蝦的個(gè)體差異不大，重量均約為1.5g，新鮮程度高。在實(shí)驗(yàn)室以海水飼養(yǎng)，保證其有頑強(qiáng)的生命活力。</p><p>　　黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)(Teneb

25、rio molitor)，由浙江海洋學(xué)院（海洋生物資源及分子工程實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室）提供。</p><p>　　昆明種小白鼠（Kunming mice），須是健康的小鼠，由浙江海洋學(xué)院（海洋生物資源及分子工程實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室）提供。</p><p><b>　　1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　Waters 600E型高效液相色譜

26、儀；高壓分子篩柱Sepax-100Å（7.8×300mm，Sepax公司）；分析型反相柱Waters SunFireTM C18 (4.6×250mm，Waters公司)；Tris-Tricine SDS-PAGE電泳試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；超純水處理系統(tǒng)（型號(hào)Millipore Syneg, Millipore公司）；真空冷凍干燥機(jī)（上海愛(ài)明儀器有限公司LGJ-10）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)

27、CF16RXII,Hitachi Koki Co.,Ltd公司）；數(shù)控超聲波清洗器（型號(hào)KQ-500DB,昆山市超聲儀器有限公司）；</p><p><b>　　1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)用水為超純水；0.5M EDTA；2mg/mL抑肽酶；TFA；乙腈；無(wú)菌海水；0.45m針頭過(guò)濾器；微量注射器；50mL離心管；1.5mL離心管；40%丙烯

28、酰胺溶液；Tricine-SDS-PAGE制膠緩沖液；50%甘油；</p><p><b>　　1.2方法</b></p><p>　　1.2.1?？侄镜奶崛?lt;/p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用的是反復(fù)凍融法提取海葵粗毒樣品。</p><p>　　在舟山市朱家尖某沿海海域淺海巖石上，采集海葵樣品。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，進(jìn)行鑒定

29、?？麡悠返念?lèi)別，并對(duì)?？M(jìn)行分類(lèi)，從中我們選取黃?？鳛檠芯繉?duì)象；</p><p>　　鑒定后，所選取出的黃?？?，在實(shí)驗(yàn)室中用海水進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在25℃左右，時(shí)間為12hr左右；</p><p>　　從海水中取出飼養(yǎng)了12hr的黃海葵樣品，并用超純水進(jìn)行沖洗，待所有?？紱_洗干凈后，將洗凈的黃?？胖糜跓?，然后把燒杯置于溫度為-80℃的冷凍箱中，迅速冷凍；</p>

30、<p>　　取一大燒杯（燒杯必須是清洗干凈的，并且用超純水沖洗過(guò)），倒入1000mL超純水，接著在燒杯中加入15mL的0.5M EDTA, 300μL 的2mg/mL抑肽酶，用玻璃棒（玻璃棒必須洗凈，并用超純水沖洗）將其充分混勻后，溶液備用；</p><p>　　從冷凍箱中取出冷凍完全的海葵樣品，待其充分溶解后，將?？麡悠返谷朐诘冢?）步中配置好的1000mL溶液中，并使?？麡悠啡拷](méi)于溶液；<

31、;/p><p>　　將盛有海葵樣品的燒杯，放置于溫度在-80℃的冷凍箱內(nèi)，冷凍樣品；</p><p>　　待?？麡悠吩诶鋬鱿渲欣鋬隽?hr后，將充分冷凍的?？麡悠窂睦鋬鱿渲腥〕?，并將其置于溫度為4℃的冰箱中融化，使?？麡悠返玫匠浞秩诨?lt;/p><p>　　重復(fù)（5），（6）兩步3-4次；</p><p>　　待?？麡悠贩磸?fù)凍融4-5次后，將融化

32、后得到的?？麡悠酚眉啿紝?duì)其進(jìn)行粗過(guò)濾，去掉海葵軀體等雜質(zhì)，過(guò)濾后得到的濾液備用；</p><p>　　將第（9）步中得到的濾液，分裝在數(shù)個(gè)50mL的離心管中，并將離心管放置于高速冷凍離心機(jī)中進(jìn)行離心，離心條件：溫度設(shè)定為4°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定為20 000 rpm，離心的時(shí)間設(shè)定為20 min，待離心結(jié)束后，取出離心管，將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50mL的離心管中；</p><p>

33、;　　?？麡悠分貜?fù)離心兩次，離心條件均為：溫度設(shè)定4°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定20 000 rpm，離心時(shí)間設(shè)定20 min，離心介紹的樣品，將上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，備用，經(jīng)過(guò)多次離心得到的上清液即為?？侄緲悠?。</p><p>　　將經(jīng)過(guò)上述處理的所有海葵粗毒樣品置于溫度是4°C的冰箱內(nèi)保存，備用。</p><p>　　1.2.2?？舅氐姆蛛x</p><p

34、>　　多維高效液相色譜法( multi dimensional high performance liquid chromatography , MDHPLC)是利用兩個(gè)或者更多的分子篩柱對(duì)樣品中待分析的組分進(jìn)行多次的分離,將經(jīng)過(guò)初次分離的全部或部分組分用另一根或多根不同類(lèi)型的色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離。利用多維高效液相色譜法技術(shù), 可適應(yīng)于各種不同的需要。其MDHPLC優(yōu)點(diǎn)如下：①提高色譜系統(tǒng)中的分離能力和選擇能力, 縮短樣品分析的

35、時(shí)間；②富集痕量組分,增加分析靈敏度；③從復(fù)雜的多種組分中，排除干擾物質(zhì), 有選擇的針對(duì)所需要的組分進(jìn)行分析；④能起到樣品的預(yù)處理作用, 而且分析柱受到的污染也較少；⑤保護(hù)靈敏檢測(cè)器，避免其受污染；⑥實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的控制常規(guī)分析, 且數(shù)據(jù)可靠, 重復(fù)性也好[26]。由于MDHPLC有諸多優(yōu)點(diǎn),所以本實(shí)驗(yàn)中采用的就是多維高效液相色譜法，對(duì)舟山黃海葵粗毒樣品進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)中所有的分離步驟都是用Waters 600E型高效液相色譜儀完成的，并

36、且都是由Waters 2487型紫外檢測(cè)器做為分離純化實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。</p><p>　　取一溶劑瓶，加滿超純水，然后用超聲波震蕩10-15min，對(duì)超純水進(jìn)行溶液脫氣處理，處理好的超純水作為洗脫液，依次打開(kāi)Waters 600E型高效液相色譜儀的各個(gè)電源開(kāi)關(guān)；</p><p>　　調(diào)節(jié)色譜儀的流速為1mL/min，對(duì)管路在不與色譜柱連接的情況下進(jìn)行沖洗。待基線平穩(wěn)后

37、，關(guān)閉流速，將色譜柱（采用Sepax-100Å 7.8×300mm，Sepax公司）靠近泵的一端接入，另一端不接，在連接色譜柱時(shí)，要注意色譜柱的流向，色譜柱的流向必須與水的流向一致，開(kāi)啟流速，對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗，并觀察基線。待基線平穩(wěn)后，另一端也接入管路。繼續(xù)沖洗，待基線平穩(wěn)后，即可進(jìn)行樣品進(jìn)樣。</p><p>　　從冰箱內(nèi)取出?？侄緲悠罚?.45m針頭的過(guò)濾器對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾，得其濾液；&

38、lt;/p><p>　　對(duì)過(guò)濾后的樣品進(jìn)行手動(dòng)進(jìn)樣，每次上樣1mL（海葵樣品必須放置在溫度是4℃的條件下），并設(shè)置流速為0.75ml/min，觀察色譜圖，并且收集各個(gè)洗脫峰的樣品，對(duì)洗脫峰和對(duì)應(yīng)的樣品進(jìn)行編號(hào)，為GF1~12，同時(shí)記錄色譜圖，收集好的洗脫峰樣品必須盡快的放入溫度為4℃的冰箱中保存；</p><p>　　每次測(cè)試完畢后，需對(duì)儀器進(jìn)行沖洗，時(shí)間一般在30min-60min，一般流速

39、為正常測(cè)樣的1至1.5倍，然后走空白，如果顯示無(wú)任何雜質(zhì)，即可進(jìn)行下一次上樣；若仍有雜質(zhì)顯示，則繼續(xù)沖洗，直至無(wú)雜質(zhì)為止，才能進(jìn)行第二次的上樣；</p><p>　　從冰箱內(nèi)取出每次上樣后得到的洗脫峰樣品，將每次上樣所收集到的各個(gè)洗脫峰樣品進(jìn)行合并于50mL的離心管中，并用封口膜對(duì)各個(gè)離心管進(jìn)行封口，然后用小針頭在封口膜上進(jìn)行打孔；</p><p>　　將封口好的樣品放置于溫度設(shè)定于-80

40、℃的冷凍箱內(nèi)，迅速凍干，時(shí)間約為1hr；</p><p>　　待一小時(shí)到后，取出凍干的樣品，并將離心管放置于冷凍干燥機(jī)中，完全干燥； </p><p>　　待樣品完全干燥后，將離心管從冷凍干燥機(jī)中取出，分別稱(chēng)取少量各編號(hào)干燥后的樣品放置于1.5mL的離心管中，并在每個(gè)離心管中各加入0.5ml的無(wú)菌海水，并使樣品完全溶解于無(wú)菌海水中，備用；</p><p>　　取出微

41、量注射器并將其清洗干凈，注射器內(nèi)部先用超純水進(jìn)行清洗，分別向水白蝦和黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)分別注射無(wú)菌海水50μL，并觀察在無(wú)菌海水注射后，兩種動(dòng)物身體的反應(yīng)，并記錄現(xiàn)象；</p><p>　　每次更換注射樣品時(shí)，必須對(duì)微量注射器用超純水進(jìn)行清洗，防止在注射器中有上一個(gè)樣品的殘留，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。用清洗好的微量注射器分別向水白蝦和黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)注射溶解于無(wú)菌海水中的各個(gè)樣品，每個(gè)樣品各注射兩只水白蝦和黃蜂蟲(chóng)，注射劑量為50μL/

42、只，并觀察注射不同編號(hào)樣品后，各動(dòng)物的反應(yīng)。若注射同一個(gè)樣品的兩只動(dòng)物反應(yīng)不一致，則應(yīng)該再注射兩只，直至反應(yīng)一致為止。并記錄各個(gè)編號(hào)對(duì)應(yīng)的動(dòng)物反應(yīng)特征及各個(gè)洗脫峰是否具有殺蟲(chóng)活性；</p><p>　　另取健康的昆明種小白鼠進(jìn)行腹腔注射各個(gè)樣品，通過(guò)腹腔注射的方式進(jìn)行不同編號(hào)樣品的殺蟲(chóng)活性的測(cè)試，觀察注射不同編號(hào)樣品后，各小鼠的身體反應(yīng)。并記錄活性測(cè)試的結(jié)果以及各個(gè)洗脫峰是否具有殺蟲(chóng)活性；</p>

43、<p>　　通過(guò)第（11）、（12）步的檢測(cè)，得到的具有殺蟲(chóng)活性的洗脫峰樣品編號(hào)，找到對(duì)應(yīng)編號(hào)的樣品組分，合并具有殺蟲(chóng)活性的各個(gè)組分的樣品，合并后的?？舅貥悠贩胖糜跍囟葹?℃的冰箱中保存，備用；</p><p>　　從Waters 600E型高效液相色譜儀上取下Sepax-100Å色譜柱（7.8×300mm，Sepax公司生產(chǎn)），配制兩份溶液一份為含0.1%TFA的超純水（A液），

44、另一份是乙腈（B液），配制好的兩份溶液均用超聲波震蕩10-15min，對(duì)兩份溶液進(jìn)行脫氣處理，處理過(guò)的液體作為反相液相色譜的洗脫液，先對(duì)管路在不與色譜柱連接的情況下進(jìn)行沖洗。待基線平穩(wěn)后，對(duì)反相色譜柱（采用SunfireTM Prep C8,10×250 mm, Waters公司）半制備柱進(jìn)行沖洗，待基線平穩(wěn)后，即可進(jìn)行樣品進(jìn)樣。</p><p>　　從冰箱取出第（13）步得到的?？舅貥悠罚謩?dòng)對(duì)樣品

45、進(jìn)行上樣，每次上樣5mL。沒(méi)有進(jìn)行上樣的海葵毒素樣品，仍需放在4℃的溫度下。設(shè)置洗脫的流速為2 mL/min，洗脫的梯度設(shè)定為0-5%B，10min；5%-45%B，30min；45%-95%B，5min。設(shè)置梯度完成后，即可運(yùn)行程序，并觀察樣品的色譜圖，收集每個(gè)洗脫峰的樣品，然后對(duì)洗脫峰和對(duì)應(yīng)的樣品進(jìn)行編號(hào)，記為R1~12，同時(shí)在記錄本上畫(huà)下色譜圖，收集好的洗脫峰樣品同樣須盡快的放入溫度為4℃的冰箱中保存；</p>&l

46、t;p>　　重復(fù)（5）—（12）步驟，對(duì)所有的?？舅貥悠愤M(jìn)行SunfireTM Prep C8的反相色譜柱的洗脫，冷凍干燥后，R1~12的12組樣品在動(dòng)物體上做殺蟲(chóng)活性的檢測(cè)；從中得到具有殺蟲(chóng)活性的洗脫峰樣品的編號(hào)，找到對(duì)應(yīng)編號(hào)的樣品組分，對(duì)具有殺蟲(chóng)活性的各個(gè)組分的樣品進(jìn)行合并，合并后海葵毒素樣品及時(shí)放于溫度為4℃的冰箱中保存，備用；</p><p>　　從高效液相色譜儀上取下SunfireTM Prep

47、 C8的反相色譜柱（10×250 mm, Waters公司生產(chǎn)），洗脫液仍然是一份為含0.1%TFA的超純水（A液），一份是乙腈（B液），兩份溶液用超聲波震蕩10-15min后即可使用。先對(duì)管路在不與色譜柱連接的情況下進(jìn)行沖洗。待基線平穩(wěn)后，對(duì)分析型反相柱Waters SunFireTM C18 (4.6×250mm，Waters公司)進(jìn)行沖洗，待基線平穩(wěn)后，即可進(jìn)行樣品進(jìn)樣。</p><p&g

48、t;　　從冰箱取出第（16）步得到的海葵毒素樣品，手動(dòng)對(duì)樣品進(jìn)行上樣，每次上樣1mL。沒(méi)有進(jìn)行上樣的?？舅貥悠罚柙?℃的溫度下保存。設(shè)置洗脫的流速為0.75mL/min，洗脫的梯度設(shè)定為0-5%B，10min；5%-45%B，30min；45%-95%B，5min。當(dāng)設(shè)置梯度完成，對(duì)梯度進(jìn)行保存后，即可運(yùn)行程序，并觀察樣品色譜圖，收集各個(gè)洗脫峰的樣品，然后對(duì)洗脫峰和對(duì)應(yīng)的樣品進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)在記錄本上畫(huà)下色譜圖，收集好的洗脫峰樣品同樣

49、須盡快的放入溫度為4℃的冰箱中保存；</p><p>　　重復(fù)（5）—（12）步驟，對(duì)所有的?？舅貥悠愤M(jìn)行Waters SunFireTM C18的反相色譜柱的洗脫，冷凍干燥后，所有得到的各個(gè)樣品在動(dòng)物體上做殺蟲(chóng)活性的檢測(cè)；從中得到具有殺蟲(chóng)活性的洗脫峰樣品的編號(hào)，找到對(duì)應(yīng)編號(hào)的樣品組分，對(duì)具有殺蟲(chóng)活性的各個(gè)組分的樣品進(jìn)行合并，合并后?？舅貥悠芳皶r(shí)放于溫度為4℃的冰箱中保存；</p><p

50、>　　1.2.3 毒素多肽的用Tris-Tricine SDS-PAGE電泳</p><p>　　實(shí)驗(yàn)中采用Tris-Tricine SDS-PAGE電泳（購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司）試劑盒對(duì)分離后，各洗脫峰的殺蟲(chóng)毒素多肽的分子量進(jìn)行初步的檢測(cè)。</p><p>　　將2塊干凈的玻璃板和2個(gè)0.75 mm的隔條，組裝玻璃平板夾層，并將其固定在灌膠支架上。</p>&

51、lt;p>　　根據(jù)平板的面積、需要制備的膠的厚度，估計(jì)需要配制的分離膠（seperating gel）和濃縮膠（stacking gel）的體積。</p><p><b>　　配制分離膠</b></p><p>　　新鮮配制10%的APS（過(guò)硫酸銨）：按每0.1克過(guò)硫酸銨干粉加1mL超純水的比例將水加到裝有硫酸銨干粉的1.5mL EP管中，搖晃到粉末全部溶解。配

52、制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。</p><p>　　在一個(gè)25mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、40%丙烯酰胺溶液和4×分離膠緩沖液。以下是配制10 mL膠的用量，更大體積則各成分用量需按比例增加。丙烯酰胺單體具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。</p><p>　　搖晃混勻后抽真空10-15分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng)，不去除將影響丙烯酰胺聚

53、合反應(yīng)）。</p><p>　　將50uL新鮮配制的 10%過(guò)硫酸銨溶液和10uL TEMED溶液加入到溶液中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。</p><p>　　灌膠。用一根巴斯德吸管，將分離膠溶液沿著一條隔條的邊緣加到玻璃板夾層中，直到玻璃板之間溶液的高度約為11cm。</p><p>　　用另一根巴斯德吸管，先從一側(cè)的隔條邊緣，再?gòu)牧硪粋?cè)的隔條邊緣緩慢的往凝膠的頂部加入一層水

54、飽和的異丁醇（厚約1cm），讓凝膠在室溫聚合30-60min。</p><p>　　傾去異丁醇，用1×Tricine-SDS-PAGE制膠緩沖液徹底沖洗后，待用。</p><p><b>　　配制4%濃縮膠</b></p><p>　　在一個(gè)50mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、40%丙烯酰胺溶液和Tricine-SDS-PAGE

55、制膠緩沖液。以下是配制12.5 mL膠的用量，丙烯酰胺單體具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。</p><p>　　搖晃混勻后抽真空10-15分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng)，不去除將影響丙烯酰胺聚合反應(yīng)）。</p><p>　　將50uL新鮮配制的 10%的過(guò)硫化銨溶液和10uL TEMED溶液加入到溶液中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。</p><p>　　灌膠。

56、用巴斯德吸管，將積層膠溶液緩緩地沿著一側(cè)隔條的邊緣加到玻璃板夾層中，直到玻璃板夾層中的溶液高度離玻璃板頂部約1cm高為止。小心不要產(chǎn)生氣泡。</p><p>　　插入0.75mm厚的塑料梳子，再補(bǔ)加濃縮膠溶液填滿梳子間的空隙，仍然注意避免產(chǎn)生氣泡。讓濃縮膠在室溫聚合30-60分鐘（低溫抑制聚合反應(yīng)）。</p><p>　　小心拔出梳子，避免撕裂凝膠加樣孔。用陰極緩沖液沖洗并加滿加樣孔。&l

57、t;/p><p>　　在電泳裝置的下層緩沖液槽中加入陽(yáng)極緩沖液（產(chǎn)品提供10 升的陽(yáng)極緩沖液干粉，將所有干粉溶解在1000mL 水中，用濃鹽酸調(diào)pH 到8.9（25℃）即得10×陽(yáng)極緩沖液，滅菌后可以4℃放置，用時(shí)再用水稀釋成1×陽(yáng)極緩沖液）安裝電泳裝置，并根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)固定上層緩沖槽。在上層緩沖槽中加入部分陰極緩沖液（產(chǎn)品提供10 升的陰極緩沖液干粉，將所有干粉溶解在1000mL 水中即得10&

58、#215;陰極緩沖液，可以室溫放置，不需要滅菌，用時(shí)再用水稀釋成1×陰極緩沖液。）至覆蓋加樣孔為止。</p><p>　　在密封的螺蓋微量離心管中，用2×Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液按1：1的比例稀釋蛋白樣品，于100℃煮沸3-5 min。 如果樣品是蛋白沉淀物，加入50-100 uL 新配的1×Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液溶解；如果樣品是蛋白稀溶液，可考

59、慮先濃縮蛋白質(zhì)。注：用考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)，對(duì)于成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，0.8 cm寬的加樣孔的加樣體積不超過(guò)20 uL（25-50 uL總蛋白質(zhì)）為宜，對(duì)于只有一種或幾種蛋白質(zhì)的樣品，只需1-10 uL的總蛋白質(zhì)。采用銀染時(shí)，樣品用量可減少10-100倍。為了得到均一的條帶，配制蛋白質(zhì)樣品時(shí)，濃度和等體積要相同。在加入Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液前后，要將樣品一直放于冰上。含Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液的樣品，

60、如未經(jīng)100℃加熱滅活蛋白酶之前，切勿將其放于室溫。</p><p>　　開(kāi)始電泳，先在30 V恒壓下電泳1 h（對(duì)0.75mm×14cm×14cm 的膠而言），接著在150 V恒壓下電泳4-5 h。注：本產(chǎn)品的Tricine-SDS-PAGE上樣液使用了考馬斯亮藍(lán)G-250作為指示劑，其泳動(dòng)速度比最小的肽還快。</p><p>　　終止電泳，取出凝膠進(jìn)行后續(xù)的染色等處

61、理。</p><p>　　戴上手套避免將手指印留在電泳膠上，將膠移入一個(gè)小的盛有少量考馬斯亮藍(lán)（20ml已經(jīng)足夠）的容器內(nèi)（小心不要將膠撕破）?；蛘邔⒉ＡО暹B同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落；</p><p>　　對(duì)于0.75mm的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩5-10min，對(duì)于1.5mm的凝膠，則需要10-20min，在染色和脫色過(guò)程中要用蓋子或封口膜密閉容器口；</p>

62、<p>　　棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色；</p><p>　　加入考馬斯亮藍(lán)脫色液（約50ml），清晰的條帶很快會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，大部分凝膠脫色需要1h，使用過(guò)的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過(guò)夜，得到電泳圖譜</p><p>　　1.2.4通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)毒素多肽進(jìn)行初步的鑒定</p><p>　　海葵殺蟲(chóng)

63、活性多肽的精確分子量是利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）（Voyager-DESTR Biospectromitry workstation，Applied Biosystems公司）進(jìn)行測(cè)定。采用線性陽(yáng)離子模式，N2光源為337 nm，離子加速電壓為20000 V?；|(zhì)采用α-氰基-4-羥基-肉桂酸（CCA，sigma公司），通過(guò)以下方式制備樣品：取1 L 樣品液加入到9 LCCA（含 0.1%TFA）的50%

64、乙腈飽和溶液?；靹蚝笕? L點(diǎn)樣，室溫干燥后測(cè)定，并采用內(nèi)標(biāo)法校正。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　2.1?？舅亟?jīng)Sepax-100A色譜柱第一次分離</p><p>　　從舟山海域黃?？刑崛〉玫降拇侄緲悠?，經(jīng)過(guò)Sepax-100A色譜柱的分離后，根據(jù)其分離圖譜（圖1），可收集到12個(gè)洗脫峰。根據(jù)洗脫

65、峰出現(xiàn)的先后順序，將其依次命名為GF1-GF12（圖1）。實(shí)驗(yàn)收集得到的12個(gè)洗脫峰經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理后，各樣品取溶解于等量的無(wú)菌海水，將其注射于水白蝦以及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)，得到12個(gè)洗脫峰注射動(dòng)物后不同的反應(yīng)（表1）。通過(guò)表1可以發(fā)現(xiàn)12個(gè)洗脫峰中，以GF2和GF3的毒性最強(qiáng)。其中經(jīng)GF2和GF3樣品注射后的水白蝦及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)均立刻產(chǎn)生抽搐并迅速死亡；經(jīng)GF1，GF5-GF12這9個(gè)樣品注射后的水白蝦以及黃粉蟲(chóng)都沒(méi)有明顯反應(yīng)，繼續(xù)存活；經(jīng)

66、GF4樣品注射后的水白蝦以及黃粉蟲(chóng)，身體先產(chǎn)生抽搐，再經(jīng)過(guò)2-5分鐘后才死亡。將毒性最強(qiáng)的兩組樣品對(duì)小鼠腹腔注射后，都導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)癱軟，呼吸困難等癥狀。而實(shí)驗(yàn)中注射了無(wú)菌海水的水白蝦、黃粉蟲(chóng)以及小鼠，在注射后都無(wú)明顯現(xiàn)象產(chǎn)生。</p><p>　　圖1：?？侄窘?jīng)Sepax-100Å分子篩分離的圖譜，共收集12個(gè)洗脫峰，分別命名為GF1~12</p><p>　　Fig.1. S

67、epax-100Å gel filtration of peptide. Sample, the crude extract from AnthopLeura xanthogrammica. fractions collected is labeled from GF1 to GF12.</p><p>　　表1：?？侄窘?jīng)Sepax-100Å分子篩分離得到的各洗脫峰，注射水白蝦后產(chǎn)生的現(xiàn)象

68、</p><p>　　Table 1.Reactions of the Exopalaemon carinicauda after injection of the Sepax-100Å gel-filtration fractions of toxins from AnthopLeura xanthogrammica.</p><p>　　2.2 海葵毒素經(jīng)C8半制備型反相HP

69、LC第二次分離</p><p>　　經(jīng)過(guò)Sepax-100A色譜柱第一次分離和對(duì)洗脫峰進(jìn)行進(jìn)行殺蟲(chóng)活性分析后，得到了其中毒性最強(qiáng)是GF2和GF3號(hào)峰，將這兩個(gè)毒性最強(qiáng)的樣品進(jìn)行合并。樣品用SunfireTM Prep C8半制備型色譜柱進(jìn)行反相HPLC，對(duì)GF2,GF3進(jìn)一步分離。樣品通過(guò)反相液相色譜洗脫后，根據(jù)樣品反相色譜圖（圖2）共收集到12個(gè)洗脫峰組分。并根據(jù)洗脫時(shí)間的先后順序分別命名為R1~12（圖2）。

70、所有洗脫峰組分經(jīng)過(guò)冷凍干燥、無(wú)菌海水溶解后，對(duì)其進(jìn)行動(dòng)物毒性的測(cè)試。測(cè)試結(jié)果表明R1，R3，R5~10以及R11具有較強(qiáng)活性，注射后的水白蝦及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)均立刻產(chǎn)生抽搐并迅速死亡；R1，R11，R12三個(gè)組分活性較弱，注射后的水白蝦以及黃粉蟲(chóng)，身體先產(chǎn)生抽搐，再經(jīng)數(shù)分鐘后才死亡；R2，R4兩個(gè)組分活性很弱，幾乎沒(méi)有活性，注射后的水白蝦以及黃粉蟲(chóng)都沒(méi)有明顯反應(yīng)，繼續(xù)存活（表2）。并對(duì)R1-12這12個(gè)組分進(jìn)行Tris-Tricine SDS

71、-PAGE電泳檢測(cè)，得到凝膠。并經(jīng)過(guò)染色和脫色處理后，得到了清晰的電泳檢測(cè)圖譜（圖3：A圖R1~R7組分的電泳檢測(cè)圖譜；B圖R8~R12的電泳檢測(cè)圖譜?！埃贝韺?duì)水白蝦以及黃粉</p><p>　　圖2：GF2+GF3號(hào)峰經(jīng)C8反相柱分離后的圖譜，共收集12個(gè)組分，分別命名為R1~12。</p><p>　　Fig.2. Reverse-phase HPLC of fraction G

72、F2+GF3 obtained from the above gel filtration. Sample, toxic fractions obtained by gel filtration; column, SunfireTM Prep C8</p><p>　　表2：GF2+GF3號(hào)峰經(jīng)C8反相柱分離得到的各洗脫峰，注射水白蝦后產(chǎn)生的現(xiàn)象</p><p>　　Table 2 . R

73、eactions of the Exopalaemon carinicauda after injection of the fractions after SunfireTM Prep C8 column of GF2+GF3 toxins from AnthopLeura xanthogrammica.</p><p>　　圖3：GF2+GF3號(hào)峰經(jīng)C8反相柱分離后，各洗脫峰的Tris-Tricine SDS

74、-PAGE電泳檢測(cè)圖譜。</p><p>　　Fig.3. Tris-Tricine SDS-PAGE of the fractions obtained from the above RP-HPLC SunfireTM Prep C8</p><p>　　2.3?？舅亟?jīng)分析型C18反相柱第三次分離</p><p>　　?？侄窘?jīng)過(guò)Sepax-100A色譜柱第一次

75、分離和SunfireTM Prep C8半制備型色譜柱進(jìn)行反相液相色譜的第二次分離，分離得到的12個(gè)洗脫峰中選擇R5,R6,R7,R8以及R11這5個(gè)具有較強(qiáng)毒性的組分。得到的五個(gè)具有較強(qiáng)毒性的組分分別用分析型C18反相柱進(jìn)行分離，各組分得到的分離圖譜如圖4所示。對(duì)五個(gè)組分的各個(gè)洗脫峰進(jìn)行了動(dòng)物毒性檢測(cè)，其中在R5樣品檢測(cè)到一個(gè)具有較強(qiáng)毒性的組分，命名為R5-1；在R6中檢測(cè)到毒性組分并命名R6-1。同理，在R7、R8、R11中得到了五

76、個(gè)具有較強(qiáng)毒性的組分，分別命名為R7-1，R7-2，R8-1，R8-2以及R11-1（圖4）。在動(dòng)物毒性檢測(cè)時(shí)，這7種多肽對(duì)水白蝦以及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)均具有很強(qiáng)的致死活性，在注射后可立刻導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抽搐、痙攣并迅速死亡。但這七種多肽在同等濃度下對(duì)小鼠無(wú)致死活性，但可引起小鼠出現(xiàn)癱軟癥狀。</p><p>　　圖4：R5~R8以及R11經(jīng)C18反相分離后的圖譜，經(jīng)動(dòng)物毒性檢測(cè)，收集7個(gè)活性組分，分別命名為R5-1, R6

77、-1, R7-1, R7-2, R8-1, R8-2和R11-1。</p><p>　　Fig.4. Reverse-phase HPLC of toxic fractions obtained from the above RP HPLC SunfireTM Prep C8. column, SunfireTM Prep C18;</p><p>　　2.4對(duì)分離后的海葵毒素質(zhì)譜分析&l

78、t;/p><p>　　海葵粗毒經(jīng)過(guò)多維高效液相色譜的分離純化和動(dòng)物毒性檢測(cè)，最終得到的7個(gè)活性組分分別為R5-1, R6-1, R7-1, R7-2, R8-1, R8-2和R11-1。然后對(duì)這七個(gè)樣品組分分別利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過(guò)質(zhì)譜分析來(lái)確定舟山黃?？懈鱾€(gè)殺蟲(chóng)活性多肽的精確分子量。各組分質(zhì)譜分析得到R5-1的分子量為3226.02, R6-1的分子量為3252.37，R7-1的分

79、子量為5021.85，R7-2的分子量為4507.32，R8-1的分子量為5018.03，R8-2的分子量為3826.98，R11-1的分子量為2788.31（圖5）。從7個(gè)活性組分的各個(gè)分子量的大小表明，舟山黃?？幕钚詺⑾x(chóng)肽的分子量在2~5 kDa之間（圖5）。其中R8-1多肽得到的多肽片段的氨基酸序列為GGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGIIWLRGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ。</p><

80、p>　　圖5：7種舟山黃?？麣⑾x(chóng)肽的質(zhì)譜分析圖，表明這些殺蟲(chóng)肽的分子量在2~5 kDa之間。</p><p>　　Fig.5. Mass spectrometric analysis of target peptides，revealed molecular masses of 5027 and 5043Da indicating the occurrence of a single oxidated fo

81、rm as the major isolation product.</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　目前，?？舅厥巧锒舅貧⑾x(chóng)肽開(kāi)發(fā)的主要研究對(duì)象，從?？舅匾呀?jīng)發(fā)現(xiàn)不少的多肽毒素，對(duì)甲殼類(lèi)的動(dòng)物具有特異致死或麻痹的作用，而對(duì)哺乳動(dòng)物沒(méi)有活性或者低毒性，其對(duì)甲殼動(dòng)物所表現(xiàn)出的選擇性毒理作用使其有望成為開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)肽的先導(dǎo)分子[1]，但該類(lèi)

82、多肽毒素的作用靶點(diǎn)尚不清楚，因?yàn)槔ハx(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)難度較大，因而從細(xì)胞水平了解?？舅貙?duì)昆蟲(chóng)的毒性機(jī)理尚存在不少困難。</p><p>　　?？舅刈鳛檠芯康臒狳c(diǎn), 主要有AP-A及AP-B兩種, AP-A特異結(jié)合在心臟Na+通道上, AP-B對(duì)心臟和骨骼肌的通道均能緊密結(jié)合, 它們都有顯著的強(qiáng)心作用。除此二種海葵毒素外,Kelso等從黃?？邪l(fā)現(xiàn)6種新毒素。其中5種類(lèi)似從A.elegantissima, A.fus

83、coviridis和Anmonia sulcata中分離得到的47個(gè)殘基的I型長(zhǎng)肽, 還有一種似乎是從A.xanthogrammica中得到的兩種49肽的嵌合體。用離子流方法在RT-4B和NTE-115細(xì)胞系中分別純化和定性;一種命名為PCR2-10，47肽能增加藜蘆定依賴型的Na+攝入, 在RT-4B和NIE-115種細(xì)胞系中的K0.5分別為329 nmol/L和1354 nmol/L. 49肽與Na+通道結(jié)合更緊密, 在上述兩種細(xì)胞

84、系中的K0.5分別為47nmol/L和108nmol/L[27].</p><p>　　目前，從?？舅刂需b定到的對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物具有特異毒性的多肽分子已經(jīng)超過(guò)12種，例如, 來(lái)自?？鸄nemonia erythraea 的AETX III，由59個(gè)氨基酸殘基組成，序列中含10 個(gè)半胱氨酸，對(duì)蟹的半致死濃度( LD50) 分別為0.53 和0.28 μg/kg體重，是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物毒性最強(qiáng)的多肽分子[28]；

85、來(lái)自?？鸖tichodactyla gigantea 的gigantoxin I，能快速麻痹蟹類(lèi)，其半有效濃度( ED50) 為215 μg/kg[29]；從海葵Antheopsis maculate 的毒素中分離到兩種對(duì)甲殼類(lèi)具有特異毒性的分子，分別為Am I和Am II，其中，Am I由27 個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)蟹類(lèi)具有致死活性，其LD50 為830 μg/kg，AmII 由46 個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)蟹類(lèi)具有麻痹活性，其ED50 為

86、420 μg/kg[30]；HONME 等人最近還從?？鸖tichodactyla haddoni 中分離到4 種新型多肽毒素，分別命名為SHTX- I，II，III 和IV，其中，SHTX- 1 和II 由28 個(gè)氨基酸組成，對(duì)蟹</p><p>　　?？谶M(jìn)化過(guò)程中發(fā)展了一套行之有效的毒素系統(tǒng)，可以用來(lái)捕獲行動(dòng)敏捷的甲殼類(lèi)以及其他獵物。我們的研究結(jié)果表明，舟山黃?？拇侄驹?00μg/kg體重濃度下注射水白蝦

87、后，在1分鐘內(nèi)即可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻痹，抽搐然后死亡；其對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性同樣表現(xiàn)出快速的特征，這表明舟山黃?？侄局懈缓瑢?duì)節(jié)肢動(dòng)物有毒性的分子，且毒性較強(qiáng)。通過(guò)采用多維高效液相色譜分離結(jié)合動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)，我們最終從舟山黃?？拇侄局蟹蛛x到7種對(duì)水白蝦和黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有殺傷作用的毒素多肽分子，在100 μg/kg 體重濃度下可導(dǎo)致水白蝦以及黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的快速致死作用，其對(duì)節(jié)肢動(dòng)物的毒性較強(qiáng)；盡管這7種毒素分子在小鼠腹腔注射后也具有毒性，但相對(duì)毒

88、性較弱，因此有望成為開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)肽的先導(dǎo)分子。質(zhì)譜分析表明，這7種舟山黃?？舅囟嚯姆肿恿吭?~5kDa左右，與已知的?？麣⑾x(chóng)肽分子量接近，均屬于小肽分子，目前，關(guān)于這7種多肽毒素的序列分析以及毒性機(jī)制仍在深入進(jìn)行中。上述研究結(jié)果表明，作為舟山海域常見(jiàn)的一種黃海葵，舟山黃?？舅刂懈缓鞣N毒素多肽，是一個(gè)研究和開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)肽以及其他活性物質(zhì)的寶庫(kù)。</p><p>　　在當(dāng)今這個(gè)科技發(fā)達(dá)的世界里，越來(lái)越多的的人發(fā)現(xiàn)，新領(lǐng)

89、域的生物資源和活性物質(zhì)方面的拓展將在在未來(lái)科技和經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)了首要的地位。海洋藥物基因、蛋白質(zhì)工程、海洋保健品開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為海洋高技術(shù)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。制備具有各種生理活性的海洋生物活性肽，應(yīng)用于藥物及保健品開(kāi)發(fā)，也已經(jīng)在世界各國(guó)展開(kāi)[32]。</p><p>　　?？涠疽褐懈缓烁鞣N多肽類(lèi)的神經(jīng)毒素，分子量為 3-7kDa 之間。其分子序列中含有多對(duì)二硫鍵，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。?？纳窠?jīng)毒素以鉀離子通道毒素和鈉離

90、子通道毒素作為主要成分。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了有作用在其他離子通道的成分。此外，還有部分的海葵毒素目前尚不清楚其分子。不同的海葵個(gè)體、不同類(lèi)型的?？舅鼐哂胁煌臻g結(jié)構(gòu)。海葵毒素多肽分子的多樣性使其成為了動(dòng)物毒素研究的重要分支。同時(shí)，?？嚯亩舅貙?duì)不同離子通道的高親和性和特異性，使它們成為了神經(jīng)生理學(xué)研究和藥理學(xué)研究的一種重要的工具。</p><p>　　現(xiàn)代藥理研究表明許多海洋生物次生代謝產(chǎn)物對(duì)害蟲(chóng)有較好的防效。?？陂L(zhǎng)

91、期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特的物質(zhì)。這些物質(zhì)的主要作用是防范潛在天敵的進(jìn)攻及捕食作用。海葵生物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性、多樣性和特殊性，為尋找新的生物農(nóng)藥提供了有利條件。</p><p>　　總之，開(kāi)發(fā)海洋多肽類(lèi)化合物，并使之商業(yè)化，不僅能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且可因其獨(dú)特的效用而造福于人類(lèi)。?？钚噪牡馁Y源非常大，?？钚噪氖且蛔鶎殠?kù),有待于人類(lèi)進(jìn)一步去挖掘，它必將為人類(lèi)的健康事業(yè)和生物農(nóng)業(yè)的開(kāi)發(fā)

92、方面做出越來(lái)越大的貢獻(xiàn)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　劉濟(jì)寧,余向陽(yáng),張存政等,海洋生物源殺蟲(chóng)活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].昆蟲(chóng)知識(shí).2004, 41(5): 409-413.</p><p>　　Kazuo Shiomi. Novel peptide toxins recently isolate

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