南極產低溫植酸酶菌的分離、產酶條件優(yōu)化及酶學性質研究.pdf

1、集萎夫學碩士學位論文南極產低溫植酸酶菌的分離、產酶條件優(yōu)化及酶學性質研究■■J●■■一In一_●J_SoIationol，t●伽zationofalOW也m口eratUrephytasefromAntarcticstrainandstudiesonenzymologicalcharacterization論文答辯日期：2Q!壘生魚且壘旦南極產低溫植酸酶菌的分離、產酶條件優(yōu)化及酶學性質研究摘要植酸酶作為一種綠色飼料添加劑，能夠有效提高飼料

2、中植酸磷的利用率，降低植酸的抗營養(yǎng)作用，從而降低生產成本，并能夠緩解糞磷排泄所造成的環(huán)境污染，在飼料行業(yè)中已經(jīng)得到廣泛應用?，F(xiàn)在應用的植酸酶大多為中高溫植酸酶，與低溫植酸酶相比它們在低溫下活性較低，而單胃動物的生理溫度在39。C左右，在水產養(yǎng)殖業(yè)中通常需要植酸酶在低于28℃具有較高的催化活性。因此，低溫植酸酶具有巨大的潛在應用價值。本研究通過兩步篩選法從南極深海沉積物樣品中分離出10株產植酸酶菌株，其中一株具有較高的植酸酶活性，命名為J

3、MUYl4。經(jīng)形態(tài)學、生理生化和26SiRNAITS區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為紅酵母屬(Rhodotorulasp)。據(jù)我們所知，這是首次有關紅酵母屬產植酸酶的報導。采用單因素試驗和響應面試驗設計相結合的方法對RhodotorulaspJMUYl4的產酶條件進行了優(yōu)化，結果如下：葡萄糖4％，蛋白胨2％，NaN0315％，KCl0025％，MgS04“7H20O025％，MnS04“H200002％，F(xiàn)eS047H200002％，發(fā)酵時間4

4、8h，發(fā)酵溫度25℃，培養(yǎng)基初始pH50，接種量10％。通過對單因素試驗結果進行分析，選取發(fā)酵溫度(℃)、接種量(％)和蛋白胨添加量(％)為顯著因子進行BoxBehnkenDesign(BBD)，結果如下：在發(fā)酵溫度26℃，接種量104％，蛋白胨添加量23％的條件下，植酸酶產量達到205447U／ml，與軟件預測的植酸酶產量201948U／ml基本一致，比優(yōu)化前大約提高了34倍。通過硫酸銨沉淀、DEAESepharoseFastFlow

5、陰離子交換層析、SPSepharoseFastFlow陽離子交換層析和SephadexG—loo凝膠過濾層析對RhodotorulaspJMUYl4的胞外植酸酶進行了分離純化，純化倍數(shù)和回收率分別為1516和5％，植酸酶的比活達到31635U／mg。RhodotorulaspJMUYl4的植酸酶具有以下特性：(1)等電點為433，分子量為63kDa；(2)最適溫度為50℃，在10℃和37℃分別保留175％和85％的酶活，表明其在低溫下具

6、有較高的活性；在45℃和50℃孵育50min分別保留648％和41％的酶活，55℃處理10min、20min、30min、40rain、50min分別保留457％、362％、229％、210％、124％的酶活，60℃或65℃處理10min酶活基本喪失；(3)最適pH為50，在pH2080穩(wěn)定性較好，適于在單胃動物胃腸道中發(fā)揮作用；(4)M92、Fe2、Fe3、K十、Na、Ca2、EDTA和EGTA能夠增強植酸酶的活性；cu2、Zn2、M

7、n2、A礦、PMSF、Phenylgloxalhydrate和SDS能夠抑制植酸酶的活性，其中Phenylgloxalhydrate是組氨酸酸性磷酸酶的特異性抑制劑。因此，RhodotorulaspJMUYl4的植酸酶屬于組氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族；(5)在O1mg／ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中37。C孵育lh，剩余酶活分別為922％和756％，表明它具有較強的蛋白酶抗性；(6)植酸酶對植酸的Km和Vmax值分別為0247mM和0