油茶內(nèi)生拮抗菌Y13定殖動態(tài)及其防治炭疽病作用機理.pdf

1、油茶炭疽病(Camellia oleifera anthracnose)是我國油茶的主要病害之一，嚴(yán)重引起落花落果，大大降低了油茶產(chǎn)量。目前對于油茶炭疽病的防治主要是化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥殘留嚴(yán)重污染了環(huán)境和生態(tài)安全，并且有害生物的抗藥性也日益嚴(yán)重。生物防治具有安全、高效及無污染等特點，因此已經(jīng)成為防治植物病害的重要途徑，受到人們的廣泛關(guān)注。本實驗室從油茶健康葉上分離得到的一株對油茶炭疽病具有良好防治效果的內(nèi)生細(xì)菌 Y13，經(jīng)鑒定該菌株為

2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。我們研究發(fā)現(xiàn)，Y13對油茶炭疽病有較好的防治效果，但田間試驗效果不穩(wěn)定。為了有效利用此菌株，本論文以內(nèi)生細(xì)菌 Y13為對象，研究 Y13在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)及對炭疽病菌的作用機理，主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)油茶內(nèi)生拮抗細(xì)菌 Y13在體內(nèi)的定殖動態(tài)。采用抗生素標(biāo)記法對 Y13進(jìn)行篩選，得到了抗利福平菌株 Y13R；通過盆栽試驗，采用噴葉，灌根和蘸根三種處理方式對油茶苗進(jìn)行

3、Y13接種處理，在不同時間內(nèi)測定了在油茶根、莖、葉內(nèi) Y13的定殖數(shù)量，不同處理方法均可使 Y13在油茶體內(nèi)各部位定殖，噴葉接種法只能在油茶葉及莖內(nèi)檢測到 Y13菌株，根內(nèi)檢測不到，且 Y13種群數(shù)量在油茶莖葉中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，第10d左右葉中定殖量達(dá)到高峰，為5.88×103cfu/g，第25d時，莖中已檢測不到 Y13菌株，在葉中的定殖量仍可達(dá)1.8×103cfu/g；蘸根處理中，Y13在根、莖中數(shù)量呈逐漸下降趨勢，在葉片中

4、數(shù)量逐漸上升，20d左右有所下降，到25d左右定殖量穩(wěn)定在1.28×103cfu/g左右；灌根處理與蘸根處理相似。從 Y13在油茶體內(nèi)的定殖部位來看，Y13在葉中的定殖量最多，根和莖中較少，從不同的處理方式比較，噴葉接種法 Y13定殖量較大，其次是蘸根和灌根。
　　 (2)Y13抗菌活性物質(zhì)的分離及其特性研究。通過平板對峙培養(yǎng)法，測定了 Y13發(fā)酵濾液對油茶炭疽病的抑菌效果可達(dá)61.2％，說明 Y13分泌有效抑菌活性物質(zhì)至胞外；

5、對發(fā)酵濾液利用有機溶劑提取活性物質(zhì)結(jié)果表明：該活性物質(zhì)不溶于有機溶劑，可被甲醇、乙醇沉淀，說明該物質(zhì)極性較大；采用酸堿沉淀法提取活性物質(zhì)結(jié)果表明，活性物質(zhì)可在酸性條件下沉淀出來，且 pH2-3時沉淀活性最強；采用不同濃度硫酸銨鹽鹽析法提取活性物質(zhì)，結(jié)果表明，活性物質(zhì)可被硫酸銨鹽析沉淀，且在70％的硫酸銨飽和度下粗提物的拮抗活性最大；硫酸銨鹽析物經(jīng)3500Da透析袋透析后測定其活性也可達(dá)39.8％，推測該類活性物質(zhì)為抗菌蛋白類物質(zhì)。對活性

6、粗提物進(jìn)行理化性質(zhì)研究，結(jié)果表明，該活性物質(zhì)對熱較穩(wěn)定，對紫外線照射不敏感，在中性 pH條件下較穩(wěn)定，在強堿條件下不穩(wěn)定，在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀，對胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K部分敏感。
　　 (3)Y13對油茶炭疽病誘導(dǎo)抗性機制。通過 Y13誘導(dǎo)處理及炭疽病菌接種油茶苗，測定了不同接種時間油茶體內(nèi)的 PAL、POD、SOD、PPO等酶活性及 MDA含量和活性氧產(chǎn)生速率變化，結(jié)果表明，Y13誘導(dǎo)處理后，PAL、POD、PPO和SO

7、D活性明顯增強。同時 Y13和炭疽病處理組誘導(dǎo)處理第3 d PAL活性達(dá)到最大，為對照的2.9倍，只接種 Y13及炭疽病處理組PAL活性于第5 d達(dá)到高峰，分別是對照組的2.1和2.8倍；POD和 SOD誘導(dǎo)后第5 d活性最高，分別比對照增加了15.5-29.5及8.5-20.5個酶活性單位；PPO誘導(dǎo)后3 d達(dá)活性高峰，7d后迅速下降?；钚匝?O2-)產(chǎn)生速率誘導(dǎo)后1 d最大，比對照增加80.6％，10d左右接近對照，Y13單獨誘導(dǎo)和