泛素化與類泛素(SUMO)化在甲殼動物免疫反應中的功能.pdf

1、甲殼動物養(yǎng)殖業(yè)是我國重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)業(yè)。然而，自1992年白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)病的爆發(fā)，給我國乃至世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，對參與病毒感染和復制的宿主蛋白進行鑒定和功能分析，對預防和控制病毒性疾病有重要的意義。泛素化和SUMO化都需要激活酶E1，結合酶E2和連接酶E3的參與，從而對靶蛋白進行特異性修飾。盡管類泛素SUMO的三維結構和酶促反應過程與泛素非常形似，但兩類

2、蛋白修飾的生物學意義卻迥然不同。本研究選擇對蝦泛素結合酶和小龍蝦SUMO結合酶，分別研究他們介導的泛素化和SUMO化在病毒感染和復制中的功能，進而闡明甲殼動物與白斑病毒相互作用的分子機理。
　　 1.中國明對蝦泛素結合酶E2(FcUbc)介導白斑綜合征病毒含有RING結構域蛋白的泛素化，并抑制病毒的復制
　　 我們從中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了一個泛素結合酶E2，命名為FcU

3、bc。FcUbc的cDNA全長967 bp，其中開放閱讀框447 bp，編碼148個氨基酸，包含一個泛素結合酶E2催化結構域(UBCc)。FcUbc特異性的分布于對蝦肝胰腺和小腸中，在受到白斑病毒刺激后，都呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢。在大腸桿菌(Escherichia coli)中重組表達并純化了FcUbc，用重組蛋白制備的多克隆抗體進行免疫組化分析，結果顯示內(nèi)源FcUbc蛋白定位于肝胰腺的B細胞和小腸的上皮細胞。
　　 為了研究其功

4、能，除了重組表達FcUbc外，我們對FcUbc的催化活性位點進行了突變，重組表達了其突變體mFcUbc。利用FcUbc重組蛋白注射對蝦，明顯降低了染毒對蝦的死亡率，并且大大抑制白斑病毒的復制。我們利用體外pull-down實驗證實重組FcUbc能夠結合病毒的四個含有RING結構域的蛋白(WRD1-4)，后者被報道具有潛在的E3連接酶的功能，而突變體mFcUbc喪失了這樣的體外結合能力。更重要的是，體外泛素化實驗和果蠅S2細胞系(Dros

5、ophila melanogaster Schneider2)上的實驗都證實了FcUbc介導了WSSV277和WSSV304的RING結構域的泛素化。在感染W(wǎng)SSV的果蠅S2細胞中，過表達的FcUbc增強了病毒W(wǎng)SSV277和WSSV304蛋白的泛素化。以上結果表明中國明對蝦FcUbc介導白斑病毒含RING結構域蛋白的泛素化，并最終抑制病毒的復制。
　　 2.克氏原螯蝦SUMO結合酶(UBC9)介導白斑綜合征病毒極早期蛋白的SU

6、MO化修飾并最終促進病毒復制
　　 我們從克氏原螯蝦(Procambarus clarkli)中克隆得到了小泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)和SUMO結合酶UBC9。UBC9 cDNA全長912bp，開放閱讀框483bp，編碼160個氨基酸，含有一個UBCc催化結構域，活性位點是位于93位的保守的半胱氨酸。SUMO cDNA全長960 bp，開放閱讀框282 bp，編

7、碼93個氨基酸，含有一個泛素樣結構域(UBQ)，其活性位點是位于C末端的雙甘氨酸殘基。序列比對和進化樹分析顯示UBC9和SUMO進化上高度保守，小龍蝦的UBC9和SUMO與酵母和人類的蛋白表現(xiàn)出極高的相似性。UBC9和SUMO組成型的存在于小龍蝦各組織，在白斑病毒刺激后呈現(xiàn)上調(diào)表達。
　　 我們在大腸桿菌中重組表達并純化了克氏原螯蝦的UBC9、SUMO，突變體mUBC9和mSUMO，及SUMO的活性形式SUMO-GG。向克氏原螯

8、蝦體內(nèi)注射UBC9或SUMO重組蛋白增強了WSSV的基因復制，而突變體mUBC9和mSUMO則喪失此功能。接下來我們進一步分析了克氏原螯蝦SUMO化系統(tǒng)促進白斑病毒復制的分子機理?？耸显rUBC9蛋白體外結合WSSV三種極早期蛋白(IE，WSV051，WSV069和WSV187)，其中只有WSV051能夠被宿主UBC9介導發(fā)生SUMO化修飾。利用干擾降低小龍蝦UBC9或SUMO的表達水平，導致病毒晚期基因表達被抑制，極早期基因表達也受