2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本研究利用共表達載體pETDuet-1-SRC88-PXRLBD在Escherichiacoli中共表達SRC88(SRC-1的88個氨基酸)和PXRLBD,獲得了可溶性表達的PXRLBD,并根據(jù)PXR與配體的結(jié)合特性,采用平衡透析模型和高效液相色譜法,建立了體外研究PXR和藥物相互作用的新方法,為體外篩選PXR的配體藥物提供了新模型。 一PXRLBD蛋白的表達1pGEX-4T-1-PXRLBDRosetta(DE3)表達菌株的

2、構(gòu)建PXRLBD片段通過BamHⅠ和XhoⅠ位點的介導插入pGEX-4T-1載體的多克隆位點。此亞克隆過程在E.coliDH5α中完成,經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化。確證和DNA序列測定確證后,轉(zhuǎn)化表達宿主E.coliRosetta(DE3)。 2GST-PXRLBD蛋白的表達與鑒定500mL2×YT培養(yǎng)基中,接種帶有pGEX-4T-1-PXRLBD重組子的Rosetta(DE3),培養(yǎng)至OD600為0.6左右,加IPTG(終濃度50μm

3、ol/L),20-25℃誘導培養(yǎng)10h。 收集細菌,對細菌破碎液,細菌破碎液上清和細菌破碎液沉淀進行SDS-PAGE,結(jié)果表明GST-PXRLBD蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在。 構(gòu)建新的表達菌株,利用SRC88與PXRLBD的共表達實現(xiàn)PXRLBD的可溶性表達。 3pETDuet-1-SRC88-PXRLBDRosetta(DE3)表達菌株的構(gòu)建SRC88片段通過NcoⅠ和HindⅢ位點的介導插入pETDue

4、t-1載體的多克隆位點-1,PXRLBD片段通過NdeⅠ和XhoⅠ位點的介導插入pETDuet-1載體的多克隆位點-2(PXRLBDC-端設計His-tag以便于蛋白純化)。此亞克隆過程在E.coliDH5α中完成,經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化確證和DNA序列測定確證后,轉(zhuǎn)化表達宿主E.coliRosetta(DE3)。 4PXRLBD和SRC88蛋白共表達500mL含1%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中,接種帶有pETDuet-1-SRC88-PX

5、RLBD重組子的Rosetta(DE3)。培養(yǎng)至OD600為0.6左右,離心去除上清,用500mL含50μmol/LIPTG的2×YT培養(yǎng)基重懸細菌沉淀,20~25℃誘導培養(yǎng)10h。 5PXRLBD蛋白的純化與鑒定表達菌液離心去除上清培養(yǎng)液,用1×PBS重懸細菌沉淀物。細菌經(jīng)Frenchpressurecellpress破碎后,超聲破碎,隨即高速離心取上清用His·BindResin純化后獲得純化液8mL。 純化液進行S

6、DS-PAGE,在分子量34KD附近出現(xiàn)明顯的PXRLBD表達條帶,在分子量10KD附近出現(xiàn)明顯的SRC88表達條帶。 純化液進行Westernblot分析,一抗為人PXR101-260aa的多克隆抗體,在分子量34KD附近出現(xiàn)明顯的PXRLBD表達條帶。 純化液經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測得純化液蛋白濃度為(0.411±0.005)g/L。 二PXR配體篩選模型的構(gòu)建將透析袋A和B放入盛有18mL含克霉唑(11

7、.1μmol/L)的1×PBS緩沖液的試管中,透析袋C和D放入盛有18mL含地塞米松(11.1μmol/L)的1×PBS緩沖液的試管中,透析袋A和C內(nèi)均加入2mL,純化的PXRLBD溶液,透析袋B和D內(nèi)均加入2mLHis·BindResinEluteBuffer作為對照組。 4℃透析,A和B透析12h達到平衡,C和D透析24h達到平衡。分別取透析袋袋內(nèi)外的溶液,其中A和C溶液加蛋白酶K(終濃度10μg/mL)4℃消化1h后加甲醇

8、(1:1)沉淀蛋白,并用高效液相色譜法進行含量分析,B和D溶液不加蛋白酶K直接加甲醇(1:1)進行含量分析。 透析平衡后,袋內(nèi)游離藥物濃度等于袋外游離藥物濃度(即袋外藥物總濃度),因此透析袋袋內(nèi)與PXRLBD結(jié)合的藥物濃度等于袋內(nèi)藥物總濃度減去袋內(nèi)游離藥物濃度即袋內(nèi)藥物總濃度減去袋外藥物總濃度。以袋內(nèi)藥物峰面積與袋外藥物峰面積的比值A作為表征,結(jié)果表明克霉唑組A=1.382±0.086,表明袋內(nèi)藥物總濃度高于袋外藥物濃度,即PX

9、RLBD與克霉唑發(fā)生結(jié)合,地塞米松組A=1.004±0.012,表明袋內(nèi)藥物總濃度等于袋外藥物濃度,即PXRLBD與地塞米松結(jié)合作用不明顯,模型建立成功。 目前乙酰膽堿酯酶抑制劑已經(jīng)成為治療輕、中度阿爾茨海默氏病的主流產(chǎn)品。經(jīng)FDA批準上市的乙酰膽堿酯酶抑制劑共5種:他克林(Tarcrine)、多奈哌齊(Donepezil,E2020)、利伐司替明(Rivastigmine)、加蘭他敏(Galanthamine)和石杉堿甲(Hu

10、perzineA),但是已有的乙酰膽堿酯酶抑制劑還存在半衰期短、較嚴重的外周膽堿能系統(tǒng)副作用等缺點,它們的臨床應用受到限制。因此,尋找作用時間長、副作用小的新一代乙酰膽堿酯酶抑制劑仍是目前AD藥物研究的熱點。 本研究利用HEK293細胞表達重組人乙酰膽堿酯酶,通過酶動力學研究考察酶活性,建立乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選模型,并應用該模型測定一系列新化合物的抑制活性。 一HEK293細胞表達重組人乙酰膽堿酯酶(rhAChE)p

11、CMV-AChE由HebrewUniversity的HermonaSoreq教授贈送。pCMV-AChE經(jīng)DNA序列測定確證AChE部分與AChE結(jié)構(gòu)基因序列(GenBankAccessionNo:NM_000665)一致。利用陽離子脂質(zhì)體lipofectamineTM2000介導pCMV-AChE瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞,rhAChE分泌表達至細胞培養(yǎng)液中,收集細胞培養(yǎng)液作為酶液分析AChE活性。 二酶活性研究 采用改

12、進的Ellman方法:反應體系中加入酶液和顯色劑DTNB(5,5'-二硫代雙-2-二硝基苯甲酸),37℃孵育5min,加入底物ATCh(碘化硫代乙酰膽堿)37℃孵育一定時間,加入SDS終止反應,用酶標儀在412nm處測定吸光度(OD值),酶反應速率v用OD/min表示。 1酶底物動力學研究反應速率對不同底物濃度作圖得底物濃度曲線,通過底物濃度曲線確定反應體系中底物濃度條件。反應速率對不同酶量作圖得酶量曲線,通過酶量曲線確定反應體

13、系中酶量條件。反應速率對不同反應時間作圖得反應時間曲線,通過反應時間曲線確定反應體系中孵育時間條件。 米氏常數(shù)Km測定的酶促反應條件:pH7.4,酶量4μL,底物濃度:0.075,0.1,0.125,0.175,0.25,0.3μmol/L,反應溫度37℃,反應時間15min,酶反應速率v用OD/min表示,1/v對1/[S]作圖獲得Lineweaver-Burk圖并回歸分析得到Km值為151.9μmol/L。 2酶活力

14、測定 酶活力計算公式:U(μmol/min)=V×A/(ε×L)計算,A表示吸光度隨時間的變化率(1/min),V表示反應總體積,消光系數(shù)ε=13.6L/mmol/mm,光程L=10mm。 1.6mL反應體系:pH7.4,酶量32μL,底物濃度1.25mmol/L,反應溫度37℃,在412nm處測定OD值,每隔0.5min讀數(shù),連續(xù)測定3min。反應測得A=0.05934/min,rhAChE酶活力為0.698mU(μm

15、ol/min)。 3酶抑制作用動力學研究多奈哌齊是AChE的可逆性抑制劑,多奈哌齊對AChE的抑制作用為競爭性和非競爭性結(jié)合的混合類型,酶抑制常數(shù)Ki和Ki'通過二次作圖法獲得:不同抑制劑濃度下進行Lineweaver-Burk作圖(一次作圖)獲得一系列曲線,一次作圖各系列的斜率對[I]進行二次作圖獲得Ki,縱軸截距對[I]進行二次作圖獲得Ki'。 反應體系條件:pH7.4,酶量4μL,多奈哌齊濃度:0,2.5,5.0,

16、10,20,40,80nmol/L,底物濃度:0.065,0.125,0.25,0.5μmol/L,反應溫度37℃,反應時間15min,通過二次作圖法測得Ki=16.03nmol/L,Ki’=18.36nmol/L。 三酶抑制劑篩選模型的建立和應用1多奈哌齊IC50的測定多奈哌齊是AChE的可逆性抑制劑,文獻報道IC50為14.0nmol/L。選擇7個濃度測定多奈哌齊對rhAChE的抑制率,以化合物摩爾濃度的負對數(shù)與酶抑制率進行

17、線性回歸求取IC50值。 反應體系條件:pH7.4,酶量4μL,多奈哌齊濃度:0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0nmol/L,底物濃度:0.125mmol/L,反應溫度37℃,反應時間15min。結(jié)果測得多奈哌齊IC50=14.0nmol/L。 2新化合物IC50的測定新化合物來源:多奈哌齊中的二甲氧基茚酮(與AChE外周位點結(jié)合)和利伐司替明的芐基胺(與AChE中心位點結(jié)合)用氧原子連

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