左旋咪唑與I2R的放射性受體配基實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：探討12R是否參與了LMS誘發(fā)炎性脫髓鞘白質(zhì)腦病的病理過(guò)程。觀察左旋咪唑(LMS)在體外試驗(yàn)中能否與正常大鼠腦組織咪唑啉2受體(12R)結(jié)合；觀察LMS能否在體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)長(zhǎng)期LMS處理大鼠腦內(nèi)的I2R產(chǎn)生影響；并觀察炎性脫髓鞘腦病動(dòng)物模型(EAE)以及左旋咪唑一完全弗氏佐劑(LMS-CFA)直接致敏并長(zhǎng)期LMS處理大鼠腦組織中12R的變化。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)一：正常大鼠腦組織I2R競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)用[3H]2-BFI標(biāo)

2、記12R，加入BU224測(cè)定非特異性結(jié)合，LMS采用0.1nM到1mM10個(gè)不同的濃度。通過(guò)測(cè)定其平衡解離常數(shù)(Ki)及50％的放射性配基結(jié)合被取代所需的競(jìng)爭(zhēng)劑濃度(IC50)觀察在正常大鼠腦組織I2R與配基的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，LMS對(duì)[3H]2-BFI是否能起競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，即測(cè)定LMS與I2R在體外結(jié)合能力；(2)實(shí)驗(yàn)二：LMS長(zhǎng)期處理大鼠腦組織12R飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將大鼠分為L(zhǎng)MS處理組和生理鹽水(NS)對(duì)照組，每組6只。LMS處理組采用腹

3、腔注射LMS10mg/Kg，每12小時(shí)1次，連續(xù)兩周；NS對(duì)照組采用腹腔注射NS0.4ml，每12小時(shí)1次，連續(xù)兩周。用[3H]2-BFI標(biāo)記12R，以飽和結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定兩組大鼠腦組織12R受體密度和親和力的變化；(3)實(shí)驗(yàn)三：LMS-CFA致敏并長(zhǎng)期LMS處理及EAE大鼠的腦組織I2R飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將大鼠分為EAE模型組、LMS致敏組及CFA對(duì)照組，每組6只大鼠。EAE模型組通過(guò)免疫當(dāng)天予四足墊皮下注射豚鼠脊髓勻漿(GPSCH)-CFA

4、的方式免疫大鼠，后予腹腔注射NS0.4ml每12小時(shí)1次，于發(fā)病高峰期處死；LMS致敏組通過(guò)免疫當(dāng)天予四足墊皮下注射LMS-CFA，后予腹腔注射LMS10mg/Kg每12小時(shí)1次，連續(xù)19天；CFA對(duì)照組大鼠通過(guò)免疫當(dāng)天予四足墊皮下注射NS-CFA的方式免疫大鼠，后予腹腔注射NS0.4ml每12小時(shí)1次，連續(xù)19天；所有大鼠均予免疫0，48小時(shí)腹股溝皮下注射百日咳菌苗0.1ml(1×109菌體)。三組大鼠腦組織I2R進(jìn)行飽和結(jié)合試驗(yàn)，檢

5、測(cè)其密度和親和力變化。 結(jié)果：(1)正常大鼠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。LMS能與[3H]-2BFI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合大鼠腦組織12R受體，且具有濃度依賴性。IC50值為1.292x10-5M，Ki值為9.796x10-6M。(2)LMS長(zhǎng)期處理大鼠腦組織12R飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)。LMS處理組I2R親和力(Kd)和受體密度(Bmax)值分別是7.274±1.929nM和432.7±71.76fmol/mg蛋白；NS對(duì)照組腦組織12R的Kd和Bmax值分別是6

6、.262±1.696nM和194.7.0±31.53fmol/mg蛋白。LMS處理大鼠腦組織的12R受體密度明顯上調(diào)(n=6，P＜0.05)，而親和力兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)LMS致敏并長(zhǎng)期處理大鼠及EAE大鼠腦組織I2R飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)。CFA對(duì)照組與LMS致敏組大鼠沒(méi)有發(fā)病，EAE組6只大鼠，發(fā)病4只。CFA對(duì)照組腦組織12R的Kd和Bmax值分別是3.367±0.94nM和162±22.19fmol/mg蛋白。EAE組大鼠腦組織I

7、2R的Kd和Bmax值分別是5.416±1.153nM和263.0±31.99fmol/mg蛋白；與CFA對(duì)照組相比，其受體密度明顯上調(diào)(n=6，P＜0.05)，而親和力明顯下降(n=6，P＜0.01)。LMS處理組腦組織12R的Kd和Bmax值分別是4.916±0.91nM和456.6±46.69fmol/mg蛋白，與CFA對(duì)照組相比，其受體密度明顯上調(diào)(n=6，P＜0.01)，而親和力明顯下降(n=6，P＜0.05)。 結(jié)論