吉西他濱衍生物Sl-01和吲唑芳基脲類化合物抗癌活性研究.pdf

1、研究背景：
　　 癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，除手術(shù)治療外，化學(xué)治療仍然是腫瘤治療的主要手段。目前臨床廣泛應(yīng)用的化療藥物除傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類藥物外，單克隆抗體、小分子化合物抑制劑等靶向藥物越來越受到重視，并已經(jīng)是目前及未來相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)引領(lǐng)化療領(lǐng)域發(fā)展動(dòng)向的主要研究方向。盡管如此，這些藥物仍然存在一定的毒副作用，并產(chǎn)生耐藥性，這可能是限制藥物成功化療的主要因素。為克服這些弱點(diǎn)，我們擬對(duì)細(xì)胞毒類藥物吉西他濱進(jìn)行前體藥物修飾，對(duì)小分子靶向抑制劑

2、索拉非尼進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。
　　 吉西他濱以抗癌活性強(qiáng)、抗瘤譜廣的特點(diǎn)在化療藥物中占居重要地位，但其在血漿和肝臟中很快被滅活，且嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性也限制其臨床應(yīng)用。我們認(rèn)為，對(duì)吉西他濱進(jìn)行前藥修飾，在胞啶環(huán)的N4位引入具有長(zhǎng)側(cè)鏈酯基酰胺基團(tuán)，在一定程度上可以增加胃腸道吸收，阻斷脫氧胞苷脫氨酶的脫氨作用，增強(qiáng)代謝穩(wěn)定性，延長(zhǎng)半衰期，提高生物利用度，從而達(dá)到增加抗癌活性，降低毒副作用的目的。我們從此系列化合物中篩選得到了SL-01(

3、N4-(3-正十二烷氧基甲?；拎?2-甲?；?-2’-脫氧-2’，2’-二氟胞苷），發(fā)現(xiàn)其具有較高的抗癌活性。本論文第一部分重點(diǎn)評(píng)價(jià)了化合物SL-01的抗腫瘤活性并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 首個(gè)口服多激酶抑制劑索拉非尼是化療藥物中比較成功的雙芳基脲類化合物，但毒副作用以及易產(chǎn)生耐藥性也是其臨床應(yīng)用所不可忽視的。根據(jù)索拉非尼的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一系列基于吲唑或氮雜吲唑的雙芳基脲類或硫脲類化合物，初步試驗(yàn)顯示出較好的

4、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。本論文的第二部分對(duì)初步篩選得到的15個(gè)化合物的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選，對(duì)篩選出的化合物1082-39（N-{4-[1-（4-溴吲唑）]苯基}-N’-[4-氯-3-三氟甲基苯基]脲），探討其對(duì)人黑色素瘤M21體外抗癌活性和作用機(jī)制。
　　 第一部分吉西他濱口服衍生物SL-01的抗癌活性研究
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?比較評(píng)價(jià)化合物SL-01與吉西他濱的抗腫瘤活性，初步探討SL-01的抗癌作用機(jī)制。<

5、br>　　 實(shí)驗(yàn)方法:選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，以MTT法檢測(cè)了SL-01對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用，Hochest33258染色法和流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)測(cè)定了SL-01對(duì)癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過建立裸鼠移植NCI-H460和HCT-116腫瘤模型，檢測(cè)了SL-01對(duì)NCI-H460和HCT-116腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，進(jìn)一步以TUNEL法檢測(cè)了SL-01

6、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率，westernblotting法檢測(cè)了SL-01對(duì)腫瘤組織caspase-9、caspase3、PARP、Bax和Bcl-2的調(diào)控作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:SL-01(0.156-20μM)與NCI-H460和HCT-116細(xì)胞分別孵育24h，48h，72h，SL-01以時(shí)間和劑量依賴性方式，顯著抑制癌細(xì)胞增殖;相同劑量下SL-01與吉西他濱對(duì)癌細(xì)胞的體外抑制活性相似。以8μMSL-01和吉西他濱分別處理細(xì)胞2

7、4h，Hoehest33258染色，可見細(xì)胞核染色質(zhì)固縮濃染、或集聚至核膜周邊、或出現(xiàn)碎裂呈珠串狀等典型凋亡現(xiàn)象。FITC-AnnexinV/PI雙染結(jié)果顯示，SL-01明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，8μM的SL-01作用24h，誘導(dǎo)NCI-H460和HCT-116細(xì)胞凋亡率分別為39.6％和41.4％，高于相同劑量下吉西他濱的凋亡活性(NCI-H460:27.8％，HCT-116:24.6％)。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，口服給予SL-01(10、20、30μ

8、mol/kg，三天一次)三周，可明顯抑制NCI-H460和HCT-116腫瘤生長(zhǎng)，抑制率分別為31.8％、43.1％、58.0％和36.4％、45.8％、63.1％，且對(duì)裸鼠體重影響不甚明顯;靜脈注射給予同劑量吉西他濱(30μmol/kg，三天一次)對(duì)NCI-H460和HCT-116腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別是41.5％和46.9％，但動(dòng)物體重下降較明顯。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行TUNEL分析，顯示SL-01處理組(10、20、30μmol/kg)腫瘤

9、組織中TUNEL陽(yáng)染率明顯增高，NCI-H460和HCT-116組織中TUNEL陽(yáng)染率分別為25.6％、41.7％、54.3％和20.7％、33.6％、47.7％，吉西他濱處理的NCI-H460和HCT-116組織中陽(yáng)染率則分別為37.2％和31.2％。Westernblotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SL-01對(duì)腫瘤組織caspase-9、caspase3和PARP裂解活化程度及對(duì)Bax/Bcl-2上調(diào)作用均明顯高于吉西他濱。
　　 實(shí)

10、驗(yàn)結(jié)論:SL-01對(duì)NCI-H460和HCT-116細(xì)胞的體外增殖抑制作用與吉西他濱相似，但對(duì)裸鼠接種的人癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯優(yōu)于吉西他濱。SL-01的抗癌活性與其誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)，符合caspase依賴性凋亡誘導(dǎo)作用機(jī)制。
　　 第二部分吲唑雙芳基脲類化合物的抗癌活性研究
　　 第一節(jié)吲唑雙芳基脲類化合物抗癌活性篩選實(shí)驗(yàn)（體外實(shí)驗(yàn)）
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?對(duì)新設(shè)計(jì)的15個(gè)基于吲唑或氮雜吲唑的雙芳基脲類或硫脲類化合物

11、篩選，初步評(píng)價(jià)篩選出的5個(gè)化合物對(duì)血管生成的抑制作用和對(duì)黑色素瘤細(xì)胞M21增殖的抑制作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:采用MTT法，檢測(cè)了1121-39等15個(gè)雙芳基脲類化合物對(duì)人腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231、PLC/PRF/5、HCT-116、786-O、NCI-H460生長(zhǎng)的抑制作用;化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞M21及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和EA.hy926

12、生長(zhǎng)抑制作用;利用劃痕損傷法，檢測(cè)化合物1121-39、1122-38和1082-39對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響;以斑馬魚胚胎模型法，檢測(cè)化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39對(duì)血管生成的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:結(jié)果顯示，除化合物1121-43、1122-26、1121-40外，新合成的其他化合物與MDA-MB-231、PLC/PRF/5、HCT-116和NCI-H460細(xì)胞分別

13、孵育72h，其IC50值多低于索拉非尼，而對(duì)于786-O細(xì)胞，只有1122-38、1082-39、1122-37、1104-40和1106-78的IC50值小于索拉非尼。篩選出的化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39與EA-hy-926細(xì)胞作用72h，其IC50值遠(yuǎn)低于索拉非尼;而對(duì)于HUVEC細(xì)胞，只有化合物1121-39的IC50值為4.81±1.97μM;對(duì)于M21細(xì)胞，化合物1122

14、-38和1082-39作用72h的IC50值遠(yuǎn)低于索拉非尼，1122-10和1122-37的IC50值與索拉非尼相當(dāng)，而1121-39對(duì)M21細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，化合物1121-39、1122-38和1082-39能抑制HUVEC細(xì)胞遷移作用，以5μM作用24h，對(duì)HUVEC的遷移抑制率分別為23.16％、41.32％和45.63％，明顯低于相同劑量下的索拉非尼的抑制率71.85％。斑馬魚胚胎模型顯示，陽(yáng)性對(duì)照藥物索拉

15、非尼顯著抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管形成，致血流停滯和不同程度心囊水腫，循環(huán)系統(tǒng)障礙，而化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39對(duì)斑馬魚胚胎體節(jié)間的血管生成無(wú)明顯影響，未見血流異常等現(xiàn)象。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:篩選獲得到的吲唑雙芳基脲類化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39，體外對(duì)多種人癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且活性優(yōu)于索拉非尼，但對(duì)斑馬魚胚胎

16、血管生成沒有影響。
　　 第二節(jié)化合物1082-39體外抗腫瘤活性研究及其機(jī)制探討
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?比較評(píng)價(jià)化合物1082-39和索拉非尼對(duì)人黑色素瘤M21的抗癌活性，探討1082-39的抗癌作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:采用MTT法，測(cè)定了化合物1082-39和索拉非尼對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞M21作用24、48、72h的半數(shù)抑制率。以流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)了1082-39與M21細(xì)胞孵育4

17、8h后的凋亡誘導(dǎo)作用。采用JC-1染色法，觀察了不同濃度1082-39作用48h，對(duì)M21線粒體膜電位的影響。提取M21細(xì)胞總蛋白，以western-blotting法檢測(cè)了M21細(xì)胞受體c-Kit表達(dá)水平，檢測(cè)了1082-39作用48h對(duì)M21細(xì)胞增殖核抗原PCNA，caspase-9、caspase3、PARP、Bax、Bcl-2、Mcl-1等凋亡相關(guān)蛋白、Akt及相關(guān)信號(hào)NF-κB、mTOR、GSK3β、c-Myc、survivi

18、n、PI3K、EGFR、Wnt2表達(dá)水平的影響;分別分離提取線粒體蛋白及核蛋白，采用western-blotting法檢測(cè)了1082-39對(duì)M21細(xì)胞色素c的重新分布及β-catenin入核的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:化合物1082-39與M21細(xì)胞分別孵育24、48、72h，其IC50值均明顯低于索拉非尼，以72h最為明顯。流式細(xì)胞術(shù)顯示，1082-39明顯引起M21細(xì)胞凋亡，作用48h后，其5μM組凋亡率40.73％，高于同劑

19、量索拉非尼的凋亡率25.26％。以0、0.625、1.25、2.5、5μM的1082-39處理細(xì)胞48h，JC-1染色為紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，綠色與紅色熒光光密度比值增加，最高組為2.71±0.2，高于索拉非尼組的光密度值之比（2.13±0.6）。Westernblotting結(jié)果顯示，與細(xì)胞孵育48h，1082-39比索拉非尼明顯下調(diào)M21細(xì)胞中PCNA表達(dá)量;1082-39顯著上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Mcl-1表達(dá)，而索拉

20、非尼則引起Mcl-1表達(dá)量明顯下調(diào)，但對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)影響較弱，二者均能上調(diào)Bax/Bcl-2，Bax/Mcl-1值，引起細(xì)胞色素c由線粒體到胞漿重新分布;對(duì)于凋亡執(zhí)行蛋白，1082-39可以明顯促進(jìn)casepase-9和casepase-3裂解活化，PARP裂解增加，而索拉非尼對(duì)casepase-9和casepase-3活化作用較弱;Westernblotting結(jié)果顯示，M21細(xì)胞中無(wú)受體c-Kit表達(dá)，但1082-39與索