熒光多參量顯微技術(shù)研究.pdf

1、熒光光譜技術(shù)和熒光顯微技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的強(qiáng)大工具。將熒光光譜學(xué)參數(shù)和熒光顯微測(cè)量相結(jié)合既提供了高度的分子結(jié)構(gòu)特異性和微環(huán)境變化信息，又提供了高的空間分辨率。生物醫(yī)學(xué)發(fā)展對(duì)檢測(cè)和成像系統(tǒng)的一個(gè)要求是在一次測(cè)量中能以很高的靈敏度和特異性得到多種功能信息。熒光光譜測(cè)量可以鑒別不同的熒光團(tuán)種類；熒光壽命測(cè)量可以對(duì)熒光分子所處微環(huán)境的pH值、離子濃度(Ca2+、Na+等)、氧壓等生理生化參數(shù)進(jìn)行定量分析，而且對(duì)于鑒別光譜嚴(yán)重重疊的多組

2、分熒光團(tuán)非常有用。因此，同時(shí)光譜和時(shí)間分辨可以提供不同的對(duì)比機(jī)制和互補(bǔ)的功能信息，引起了人們的廣泛關(guān)注。生物醫(yī)學(xué)發(fā)展對(duì)檢測(cè)和成像系統(tǒng)的另一個(gè)要求是能夠無(wú)損、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程。多焦點(diǎn)多光子顯微術(shù)(MMM)可以實(shí)現(xiàn)樣品的三維快速多光子激發(fā)熒光顯微成像，并具有對(duì)活體樣品損傷小，成像深度大，圖像信噪比高等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了MMM與熒光壽命測(cè)量相結(jié)合的快速成像，但時(shí)間分辨率不夠高，更為突出的問(wèn)題是不能給出光譜分辨信息。針對(duì)這些難以解決

3、的問(wèn)題，本論文主要完成了以下幾方面的研究工作： 1.進(jìn)一步闡明了與本課題密切相關(guān)的熒光顯微術(shù)的理論與技術(shù)問(wèn)題。 2.提出了一種兩維空間同時(shí)光譜分辨技術(shù)，并討論了兩維離散點(diǎn)獲得最佳光譜分辨率的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)面陣探測(cè)器上同時(shí)記錄兩維空間的光譜圖像，掃描效率隨激發(fā)點(diǎn)數(shù)線性提高。利用它可同時(shí)獲得樣品的熒光光譜和二次諧波圖像。 3.參與設(shè)計(jì)和研制了一臺(tái)重復(fù)頻率達(dá)到1MHz、可用于兩維空間探測(cè)的皮秒同步掃描相機(jī)，發(fā)

4、展了基于掃描相機(jī)的時(shí)間分辨單／雙光子激發(fā)熒光光譜技術(shù)，可同時(shí)獲取樣品的熒光光譜信息和壽命信息，并對(duì)掃描相機(jī)的掃描速度、時(shí)間分辨率及非線性等進(jìn)行了標(biāo)定。 4.實(shí)現(xiàn)了一種基于同步掃描相機(jī)的兩維空間同時(shí)光譜和時(shí)間分辨技術(shù)，把所獲得的離散點(diǎn)的時(shí)問(wèn)分辨光譜圖像看作是在兩維空間的取樣值，通過(guò)對(duì)樣品的三維精密微位移，即可獲得五維熒光多參量顯微功能圖像。 5．建立和標(biāo)定了基于同步掃描相機(jī)的時(shí)間分辨雙光子激發(fā)熒光光譜測(cè)量(tr-TPEFS

5、)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)熒光染料及其混合溶液、熒光生物分子的時(shí)間分辨熒光光譜測(cè)量對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了測(cè)試，獲得了一種解決組織中多熒光團(tuán)或多組分熒光參數(shù)分離的有效方法，并利用該系統(tǒng)測(cè)量了生物樣品的時(shí)問(wèn)分辨自體熒光光譜特性。 6.建立和標(biāo)定了同時(shí)光譜和時(shí)間分辨多焦點(diǎn)多光子顯微(SSTR-MMM)系統(tǒng)，進(jìn)行了同時(shí)光譜和時(shí)間分辨采樣成像原理實(shí)驗(yàn)，演示了SSTR-MMM系統(tǒng)的五維熒光顯微成像功能，并初步探索了該技術(shù)在生物組織成像及疾病診斷中的應(yīng)用。利用