豬附植前期不同形狀孕體差異表達(dá)基因的篩選與PLET1基因在胎盤發(fā)育中的功能初步研究.pdf

1、妊娠期豬胚胎/胎兒死亡會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)仔數(shù)降低，而胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩會(huì)造成低初生重仔豬數(shù)目增加，這些低出生重的仔豬對(duì)疾病的抵抗能力及飼料利用率均降低，因此，嚴(yán)重影響母豬的繁殖效率。胚胎的附植及胎盤的建立和發(fā)育直接影響著胎盤效率，是成功妊娠的重要過(guò)程。胎盤的大小及轉(zhuǎn)運(yùn)功效決定了胎盤效率的高低，在附植前期及附植期，豬孕體滋養(yǎng)層會(huì)經(jīng)歷一個(gè)形態(tài)迅速重塑的過(guò)程，其形態(tài)從球形(約10mm)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀（約150mm），滋養(yǎng)層擴(kuò)張重塑的目的是在子宮中占據(jù)足夠

2、的位置進(jìn)行附植，因而也決定了胎盤的大小。隨后孕體滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞粘附形成上皮絨毛膜型胎盤，建立母體與胎兒之間的轉(zhuǎn)運(yùn)通道。因此本研究首先以滋養(yǎng)層快速重塑的球形和線形孕體為材料，通過(guò)差異表達(dá)基因的篩選，檢測(cè)與豬胚胎附植及胎盤建立相關(guān)的基因及調(diào)控通路。其次，從差異表達(dá)基因中選取PLET1基因?yàn)楹蜻x基因，研究該基因在胎盤建立及發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)芯片雜交分析分別篩選到梅山和大白豬的球形和線狀孕體中

3、的差異表達(dá)基因，對(duì)比發(fā)現(xiàn)只在大白豬中上調(diào)表達(dá)的基因有410個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有634個(gè)。只在梅山豬中上調(diào)表達(dá)基因288個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因292個(gè)。因此，大白豬孕體中的差異表達(dá)基因遠(yuǎn)多于梅山豬，即梅山豬孕體在附植前期的基因表達(dá)更趨于平穩(wěn)。此外，兩個(gè)品種中共同上調(diào)表達(dá)基因有345個(gè)和共同下調(diào)表達(dá)基因有379個(gè)，推測(cè)這些基因可能是調(diào)控孕體發(fā)育所必需的基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種豬孕體中差異表達(dá)基因均涉及與血管生成

4、、激素應(yīng)答、細(xì)胞增殖等，說(shuō)明這些過(guò)程是孕體延長(zhǎng)所必需的，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)只在梅山豬孕體中差異表達(dá)基因涉及的信號(hào)通路主要是與細(xì)胞外基質(zhì)作用、胺類生物合成、黏著斑等少數(shù)信號(hào)途徑，而只在大白豬孕體中差異表達(dá)基因則涉及激素合成、補(bǔ)體系統(tǒng)、粘多糖降解、鈣離子信號(hào)途徑等多個(gè)信號(hào)通路，也說(shuō)明大白豬孕體在延長(zhǎng)過(guò)程中基因表達(dá)變化可能會(huì)引起細(xì)胞的許多功能發(fā)生改變。
　　2.PLET1是一個(gè)在形態(tài)重塑期的梅山豬和大白豬孕體中均上調(diào)表達(dá)的基因，推測(cè)其表達(dá)可能對(duì)

5、孕體滋養(yǎng)層的延長(zhǎng)是必要的。我們首先檢測(cè)PLET1基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)PLET1在囊胚期表達(dá)量較低，而在附植后直到整個(gè)妊娠末期表達(dá)量迅速上升，驗(yàn)證了PLET1基因是一個(gè)胚胎延長(zhǎng)期的差異表達(dá)基因，并且發(fā)現(xiàn)PLET1基因在豬胎盤發(fā)育過(guò)程中也是上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明其可能也參與胎盤的發(fā)育過(guò)程。
　　3.對(duì)豬PLET1基因的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):(1)通過(guò)原位雜交及免疫熒光檢測(cè)到PLET1只在孕體和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)，證明其可以作為胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞的標(biāo)記

6、基因，用于滋養(yǎng)層細(xì)胞的分選。(2) PLET1在妊娠不同時(shí)期的滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)定位也發(fā)生變化，即從妊娠50天開始，隨著胎盤褶皺的形成和進(jìn)一步發(fā)育，PLET1蛋白逐漸向滋養(yǎng)層細(xì)胞頂端聚集，表達(dá)位置進(jìn)一步貼近母體子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，推測(cè)PLET1可能影響滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞的相互作用。(3)通過(guò)3'RACE技術(shù)鑒定到豬胎盤中表達(dá)3'UTR長(zhǎng)度不同的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，證實(shí)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本是由于選擇性加尾信號(hào)導(dǎo)致的，并且熒光定量分析結(jié)果顯示，兩個(gè)

7、轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量比值隨著妊娠的進(jìn)程而改變，說(shuō)明雖然這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼相同的蛋白質(zhì)，但是它們?cè)谔ケP的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的功能可能并不完全相同。(4)在體外細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)PLET1基因的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)活性更高，并且PLET1的表達(dá)受miR-181a、miR-181c和miRNA-365-3p的調(diào)控。
　　4.對(duì)PLET1蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析，預(yù)測(cè)其可能存在N-連接的糖基化修飾，經(jīng)蛋白質(zhì)糖基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PLET1蛋白在胎盤中主要是以糖基化形式存