STY及SPA的RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、【目的】
　　建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實時熒光定量PCR檢測法，具體包括：
　?。?）傷寒沙門氏菌SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法。
　　（2）傷寒及甲型副傷寒沙門菌TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。評價以上方法的特異性、敏感性、檢測下限、以了解人群中對該菌的攜帶情況提高感染人群中傷寒及甲型副沙門氏菌的檢出率。
　　【方法】
　　對建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實時熒光定量PCR檢測法

2、，本研究采取以下實驗方案：
　?。?）經(jīng)查閱資料后確定待測目的基因，并通過序列比對確定待檢測基因的保守序列STY1633（Salmonella Typhi）及SPA4289（Salmonella enterica serovars paratyphi A），然后借助探針設(shè)計軟件Beacon Designer7.7設(shè)計單重及雙重實時熒光定量PCR引物和探針。
　?。?）分別在1-10 nmol/L10個濃度梯度和2-10 nm

3、ol/L5個濃度梯度內(nèi)，在美國Bio-Rad公司的CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增比較，優(yōu)化引物和探針濃度。
　?。?）SYBR Green實時熒光定量PCR靈敏度、特異度的評價。
　?。?）SYBR Green法檢測糞便模擬標(biāo)本中的傷寒沙門菌，評價其敏感性、特異度、檢測下限、菌液增菌前后的檢測下限。
　?。?）單重TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度、特異度的評價。
　?。?）將優(yōu)化了的單重實時PC

4、R反應(yīng)體系組合成雙重TaqMan實時PCR反應(yīng)體系，并評價其檢測下限。
　　【結(jié)果】
　　（1）利用SYBR Green法檢測糞便模擬標(biāo)本中的傷寒沙門菌純菌及10份傷寒患者標(biāo)本均擴(kuò)增陽性，其余的非傷寒沙門菌、致腹瀉的其他5種腸道致病菌及引起發(fā)熱癥狀的8種常見非腸道病原菌純菌及相應(yīng)患者標(biāo)本均擴(kuò)增陰性。在對純傷寒沙門菌DNA檢測中，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法的檢測下限為500fg/反應(yīng)，即97個拷貝/反應(yīng)。以糞便模擬樣品提取DN

5、A為模板的檢測中，增菌前檢測下限達(dá)104 cfu/g，增菌后可達(dá)50cfu/g。
　　（2）在單重TaqMan實時熒光定量PCR法檢測傷寒沙門菌的反應(yīng)體系中，優(yōu)化后的反應(yīng)體系靈敏度和特異度均為100％。檢測傷寒沙門菌純菌DNA的檢測下限為100fg/反應(yīng)，即19.4個拷貝/反應(yīng),擴(kuò)增效率為90%。以傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前檢測下限即可達(dá)1cfu/g。
　　單重TaqMan實時熒光定量PCR法檢測甲型副

6、傷寒沙門菌純菌DNA的檢測下限2.5pg/反應(yīng)，即485個拷貝/反應(yīng)，擴(kuò)增效率為90%。以甲型副傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測中，增菌前達(dá)未檢出，但增菌后檢測下限可達(dá)10cfu/g。
　　（3）經(jīng)優(yōu)化的傷寒和甲型副傷寒雙重TaqMan實時熒光定量PCR反應(yīng)體系中，對兩種純菌DNA的檢測下限為分別為1pg/反應(yīng)和2.5pg/反應(yīng)，即194個拷貝/反應(yīng)和485個拷貝/反應(yīng)。對各自的糞便模擬樣品的檢測下限分別為：傷寒糞便模擬樣品

7、增菌前為102cfu/g，增菌后的檢測下限是1cfu/g；甲型副傷寒糞便模擬樣品增菌前為104cfu/g，增菌后的檢測下限是10cfu/g。
　　【結(jié)論】
　　本研究建立了基于STY1633基因及SPA4289的實時熒光定量PCR方法。實驗結(jié)果證明該檢測法的特異度、靈敏度及檢測下限均較理想。尤其在單重TaqMan實時熒光定量PCR法檢測傷寒沙門菌其檢測下限能達(dá)到19.4個拷貝/反應(yīng)，高于普通PCR檢測法的100-500倍。并