TGase1,ACPase及APLPase A2酶活性參與脫屑機理和異常脫屑療效的探討.pdf

1、背景：正常皮膚表皮細胞中,95％為角質(zhì)形成細胞(keratinocyte,KC),其余5％的細胞為黑色素細胞,朗旱氏細胞以及梅克氏細胞。此種角質(zhì)形成細胞由基底膜上的基底干細胞增殖增大成為棘細胞,進行分化并向淺層移行為顆粒層和角質(zhì)層。在棘細胞層中,角質(zhì)形成細胞內(nèi)分化產(chǎn)物有角質(zhì)蛋白絲和板層小體等。板層小體內(nèi)除去脂類以外,還有溶酶體酶(lysosomal enzyme),如酸性磷酸酶(acid phosphotase,ACPase)、酸性磷脂

2、酶A(acid phospholipase A,APLPase A2)等則分泌至KC之間。它與KC加厚的細胞膜套,即角化膜套(cornified envelope),及細胞間隙的脂質(zhì)膜套(lipidenvelope)借助轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1(transglutaminasel,TGase1)活性的交聯(lián)作用而共同形成表皮屏障(epidermal barrier)。淺層角質(zhì)的KC相互解離,凋亡而脫屑。異常脫屑患者的表型呈現(xiàn)KC相互之間不解離而堆積

3、為片狀鱗屑。板層魚鱗病(LI)患者為隱性遺傳的KC代謝異常;銀屑病為免疫源性炎癥的KC代謝異常。兩者KC的代謝異常皆可導(dǎo)致凋亡不全(角化不全/凋亡不全(parakeratosis/paraapoptosis),呈現(xiàn)異常脫屑。臨床上常應(yīng)用尿素、維A酸以及激素等對癥治療異常脫屑,這些藥物具有一定療效,但可呈現(xiàn)副作用,如表皮萎縮和導(dǎo)致表皮屏障功能不良等。Fartasch M等學(xué)者曾將低濃度a-羥酸類的乙醇酸應(yīng)用于表皮脫屑研究。他們認為乙醇酸可

4、降解淺層角質(zhì)KC間的橋粒物質(zhì)而脫屑,但并不損害皮膚的屏障功能。關(guān)于正常/異常脫屑的機理及對異常脫屑的對癥治療方面國內(nèi)外研究報道的很有限,但在臨床上卻是常見的問題。本研究一方面觀察不同濃度乙醇酸對不同程度的異常脫屑患者的應(yīng)用方式;另一方面,通過對比異常脫屑患者和健康人皮屑內(nèi)酸性磷酸酶活性和酸性磷脂酶A2活性和反映表皮屏障功能的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1活性等探討正常/異常脫屑的機理。本研究采取板層魚鱗病(LI)和尋常銀屑病(PV)患者的鱗屑鋪片標本,

5、以健康人為對照,應(yīng)用組織/細胞化學(xué)方法進行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1活性,酸性磷酸酶活性和酸性磷脂酶A2活性檢測,進一步探討表皮脫屑的機理。并對LI志愿者(對個別重度LI患者進行TGase1基因測序)的局部皮膚每日一次施以低濃度的乙醇酸-甘油,對異常脫屑(呈片狀磷屑)患者進行初步療效觀察,為異常脫屑患者的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　材料與方法：1.采集標本對10例LI患者(4例重度,4例中度及2例輕度),10例尋常型銀屑病患者和10例健康志愿

6、者收集皮屑標本,低溫保存。另對一例重癥LI患者抽取10ml靜脈血用枸櫞酸鈉抗凝后送基因公司檢測TGM1基因序列。2.不同濃度乙醇酸對不同程度的異常脫屑LI患者的應(yīng)用方式以乙二醇為溶劑,36％的乙醇酸為溶質(zhì),配成不同濃度的乙醇酸溶液。對重度LI患者應(yīng)用終濃度3-4％的乙醇酸-甘油(50％甘油);對中、輕度LI患者應(yīng)用1-2％的乙醇酸-甘油,每日一次局部外用,2周后觀察照相。3.顯示酸性磷酸酶活性對鱗屑鋪片標本用10％的福爾馬林鈣固定30m

7、in→底物孵育液(醋酸鈉0.585g+雙蒸水5ml→取2.5ml+1ml8.5％NaCl+0.1N HCl+4ml雙蒸水→取6ml+3.3％硝酸鉛0.19ml+雙蒸水16ml+3.2％beta甘油磷酸鈉2ml+0.6％MgSO40.5ml以1N HCl調(diào)至pH5.6,用前過濾。)滴在玻片上,置37℃溫箱4h→蒸餾水洗→1％醋酸作用30s→蒸餾水洗3次→2％(NH4)2S1-2min流水→洗5min→顯微鏡下觀察照相(同時做不加底物培育的

8、陰性對照)。4.TGase1酶活性的檢測首先制備鱗屑鋪片標本和HRP(辣根過氧化物酶)—單丹酰偶聯(lián)物(HRP-MDC);HRP-MDC的制備和檢測TGase酶活性如下:①活化/氧化HRP以過碘酸活化/氧化HRP,4℃下以1mmol/L醋酸緩沖液透析過夜除去多余的NaIO4。②4mg單丹酰尸胺(mono-dansyl cadaverine,Sigma,US)溶于1ml PBS,與活化的HRP室溫攪拌3h,形成偶聯(lián)物。③加新配的0.05ml

9、(4mg/ml)NaBH4(硼氫化鈉,Sigma,US),4℃反應(yīng)2h,還原Schiff堿。④以HRP-MDC檢測TGase酶活性:A液0.05mol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L CaCl2,1％BSA與B液HRP-MDC混合(1:1),4℃過夜孵育各鱗屑鋪片標本,DAB顯色。⑤同時做不加底物孵育的陰性對照。⑥顯微鏡下觀察,照相。5.顯示酸性磷脂酶A2活性作用底物(1％卵磷脂水溶液10ml、2％氯化鈣水溶液1

10、0ml、0.1M甘氨酸緩沖液,pH5.5)→將底物滴在玻片上37℃浸漬15-36h→蒸餾水洗2-3min→加入膠體Nile藍60℃染色30min→水沈2-3 min→顯微鏡下觀察照相(同時做不加底物培育的陰性對照)。6.統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用圖像分析儀(Shan Fu,China)掃描灰度均值(GSM)采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件行單因素方差分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((?)±s)表示,以α=0.05為檢驗顯著性水準。
　　結(jié)

11、果：1.一例重度L1患者的TGM1基因測序,顯示TGase1基因突變主要為第Ⅲ外顯子內(nèi)第150位堿基(T)缺失,而導(dǎo)致移碼突變。2.多數(shù)(80％)LI患者治療,包括經(jīng)TGM1基因測序的重度L1患者,1-4周后異常脫屑表型可獲得一定改善。3.健康人ACPase酶活性呈黑色細顆粒主要定位于KC的細胞間橋,異常脫屑患者酶活性呈非特異的灰色,活性缺乏或缺如,很少見到細胞間橋處呈酶活性。4.健康人TGase1酶活性呈棕色細顆粒定位于KC表面,異常

12、脫屑患者酶活性皆缺乏或缺如。5.健康人APLase A酶活性呈蘭色細顆粒定位于KC細胞間隙。異常脫屑患者酶活性皆缺乏或缺如。
　　結(jié)論：1.ACPase和APLPase A2酶參與脫屑過程,它們定位于角質(zhì)形成細胞間隙,患者組中明顯缺如。2.TGase1酶定位于角質(zhì)形成細胞的表面,參與角化膜套和類脂膜套的交聯(lián),患者組中明顯缺如。3.低濃度的乙醇酸和甘油對癥治療魚鱗病能明顯改善板層魚鱗病的表型,包括一例經(jīng)TGM1基因測序的重度LI患者