VEGF對低氧誘導腫瘤細胞耐藥調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的：低氧是實體瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在的環(huán)境條件之一，是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動因子。低氧可以促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor， VEGF)的表達，也是腫瘤細胞對許多化療藥物產(chǎn)生耐藥的重要原因之一。在這一基礎(chǔ)上，本文研究了VEGF對低氧誘導腫瘤細胞產(chǎn)生耐受的作用，并進一步探討了VEGF的中和抗體Anti-VEGF是否可以提高低氧環(huán)境中抗腫瘤藥物依托泊苷(Etoposide)的藥

2、效作用進而改善缺氧腫瘤細胞對化療藥物的耐受性。
　　 方法：1)采用MTT法測定不同氧壓條件下Etoposide在體外抑制人神經(jīng)母細胞瘤細胞CHP126、人肺癌細胞A549及人肝癌細胞SMMC-7721的活性，繪制細胞生長抑制曲線。2)采用DAPI熒光染料染色觀察Etoposide引起A549細胞的凋亡情況。3)采用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)測定Etoposide對CHP126、A549及SMMC-7721細胞的周期分布情況.4)采

3、用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)測定Etoposide對CHP126、A549及SMMC-7721細胞的凋亡率。5)采用Western blotting法分別檢測低氧及VEGF抗體對CHP126細胞相關(guān)蛋白的影響(Bax、Bcl-2、Procaspase3、VEGF、p-ERK1/2、HIF-lα)，和常氧、低氧條件下Etoposide對A549及SMMC-7721細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、Proca

4、spase9、Procaspase3、PARP)、G2/M周期相關(guān)蛋白(Cyclin B1、Cdc2、Cdk7)及HIF-lα、VEGF、Flt1、p53、ERK1/2和Akt等蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果：1)低氧條件下CHP126細胞對Etoposide產(chǎn)生耐藥.在常氧條件下，Etoposide對CHP126細胞表現(xiàn)出較強的體外增殖抑制能力，其在48 h和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為0.78±0.09μM和0.

5、24±0.02μM；而在低氧(3％O2)條件下Etoposide作用相同時間得到的IC50值均大于50±M.Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，0.5±M的Etoposide在常氧下的CHP126細胞中作用0 h、24 h、48 h及72 h的凋亡率分別為5.48％、35.45％、63.78％及76.48％；而低氧(3％O2)條件下相同濃度的Etoposide作用上述時間后僅引起10％左右的細胞發(fā)生凋亡。2

6、) VEGF在CHP126細胞的低氧耐受過程中發(fā)揮重要作用。Western blotting結(jié)果顯示，CHP126細胞在低氧(3％O2)環(huán)境中處理0 h、12 h和24 h后，Bax/Bcl-2比值出現(xiàn)先升后降的變化；Procaspase3蛋白則相應(yīng)地先下調(diào)后上調(diào)；在這過程中VEGF則隨時間發(fā)生穩(wěn)定的累積.用外源性人重組內(nèi)皮生長因子(rhVEGF165)處理后，CHP126細胞內(nèi)的Bcl-2和Procaspase3表達量均顯著增加，這提

7、示VEGF在細胞低氧適應(yīng)及耐受過程中發(fā)揮了重要作用.rhVEGF165還可以刺激VEGF及HIF-lα的表達水平升高；而Anti-VEGF可以逆轉(zhuǎn)這一作用。Western blotting檢測結(jié)果還顯示，在CHP126細胞株內(nèi)不表達或弱表達Flt1，而在A549及SMMC-7721細胞中Fltl的表達量豐富。3)VEGF調(diào)控A549和SMMC-7721細胞內(nèi)HIF-lα蛋白的表達.在A549和SMMC-7721細胞內(nèi)，低氧作用1h、2h

8、和4h后，HIF-lα、VEGF和Flt1的蛋白表達均升高；Anti-VEGF使同等條件下這三個蛋白的表達均下降，rhVEGF165則可以進一步增加三者的含量。而與在CHP126細胞中的觀察結(jié)果相似，Etoposide在低氧(0.6％ O2)條件下對A549及SMMC-7721細胞分別作用48 h、72 h的生長抑制作用顯著低于常氧條件，其抗腫瘤活性降低。4)Anti-VEGF與Etoposide聯(lián)用不影響A549及SMMC-7721細

9、胞的周期分布結(jié)果。采用PI單染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測到10μM的Etoposide在常氧、低氧(0.6％ O2)條件下在A549細胞中作用48 h引起的G2/M期阻滯率分別為80.55％和38.39％；1.25μM的Etoposide在SMMC-7721細胞上則分別引起87.97％和58.65％的G2/M周期阻滯。而低氧(0.6％ O2)條件下Anti-VEGF及rhVEGF165在兩個細胞株中的預孵育所引起的細胞周期阻滯情況與Etopos

10、ide單用時相比，沒有明顯的變化。Western blotting法檢測了G2/M期主要的調(diào)控蛋白，發(fā)現(xiàn)Etoposide作用后均可引起A549與SMMC-7721細胞內(nèi)Cyclin B1顯著的增加，而低氧(0.6％ O2)下同濃度的Etoposide對該蛋白的累積能力明顯下降。Anti-VEGF的預孵育不影響Cyclin B1、Cdc2、Cdk7的表達。5)Anti-VEGF與Etoposide聯(lián)用促進低氧下SMMC-7721細胞的凋

11、亡。DAPI染色證實，Etoposide在常氧條件下作用48 h可以誘導A549細胞發(fā)生顯著的細胞核固縮.在低氧(0.6％ O2)條件下，未觀察到明顯的核變化；加入Anti-VEGF預處理不影響DAPI染色的結(jié)果.Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果則顯示，常氧環(huán)境中1.25μM的Etoposide作用于SMMC-7721細胞0 h和48 h的凋亡率分別為8.10％和18.75％，而Etoposide與Anti-

12、VEGF或rhVEGF165的共孵育引起的凋亡率分別為19.20％和16.43％；低氧(0.6％ O2)環(huán)境中上述給藥方式相應(yīng)的凋亡誘導率分別為6.87％、12.64％、23.86％和18.13％，顯示Anti-VEGF與Etoposide的聯(lián)用可以明顯地逆轉(zhuǎn)SMMC-7721細胞內(nèi)低氧相關(guān)的Etoposide耐受情況.Western blotting結(jié)果表明低氧(0.6％ O2)條件下Anti-VEGF預處理組SMMC-7721細胞的

13、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達出現(xiàn)進一步的下調(diào)，caspase9出現(xiàn)活化片段，Procaspase3也出現(xiàn)下調(diào)并促使PARP產(chǎn)生裂解片段，表明激活了凋亡通路.6)Anti-VEGF發(fā)揮作用可能與p53的有效積累相關(guān).Etoposide在常氧下作用于A549及SMMC-7721細胞均能促進p53蛋白表達量的累積.而僅在SMMC-7721細胞內(nèi)，Anti-VEGF和Etoposide合用可以刺激低氧(0.6％ O2)條件下p53的重新積聚.Ak

14、t及ERK1/2通路在低氧介導的Etoposide耐受中均發(fā)揮作用.Anti-VEGF預處理在低氧(0.6％ O2)條件下對Akt及ERK1/2信號途徑均沒有明顯影響。
　　 結(jié)論：VEGF在神經(jīng)母細胞瘤CHP126細胞的低氧耐受中起到了非常重要的作用。在VEGF受體Flt1高表達的人肺癌細胞A549及人肝癌細胞SMMC-7721內(nèi)，低氧誘導產(chǎn)生HIF-lα、VEGF及Flt1的表達；而VEGF的累積則可以進一步增加HIF-lα