人溶菌酶乳腺生物反應器的初步研究.pdf

1、人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)能水解細菌細胞壁粘多糖的β-1，4糖苷鍵，所以對革蘭陽性細菌具有直接的溶解作用，在分泌型免疫球蛋白A和補體的參與下對革蘭氏陰性細菌具有間接的溶解作用，此外它還具有消炎、消腫、組織修復、改善組織局部血液循環(huán)和分解膿液等藥理作用。因此在醫(yī)學、食品工業(yè)等領域得到十分廣泛的應用。 為了防治奶牛乳房炎，提高奶牛的抗病能力，試圖通過轉基因動物的方法提高人溶菌酶在奶牛乳腺細胞中表達，以降低乳房

2、炎的發(fā)病率。本研究在克隆出牛β-乳球蛋白基因5’調控序列的基礎上，結合本實驗室已克隆出人溶菌酶cDNA序列，構建人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體pBEL，并通過電穿孔的方法研究其在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞表達情況。通過G418篩選陽性細胞，為本實驗室利用核移植技術生產轉基因動物提供細胞來源。研究結果如下： 1.利用PCR方法擴增了牛β-乳球蛋白基因5'調控成分，其中包括部分上游序列，第一外顯子及第一內含子(933bp)。PCR產物

3、回收純化后，克隆在pMDl8-T Vector的T位點。序列分析結果表明：該序列與牛β-乳球蛋白突變體B前體基因、牛β-乳球蛋白基因突變體B、牛β-乳球蛋白基因的同源性分別為99％、99％、98％。軟件分析表明：該序列包括一些表達所需的調控成分，可用于構建乳腺表達載體。 2.利用雙酶切定向克隆的方法，將真核表達載體pEGFP-Cl構建成含有抗性基因、報告基因、人溶菌酶基因eDNA的真核表達載體pEGFP-hLYZ。用PCR和雙酶

4、切方法檢測，表明插入的人溶菌酶基因位點正確無誤，沒有發(fā)生影響表達的突變。 3.利用雙酶切定向克隆的方法，將擴增的牛β-乳球蛋白基因的5'調控序列序列取代真核表達載體pEGFP-hLYZ的部分CMV作為啟動子，構建人溶菌酶乳腺特異性表達載體pBEL，載體有抗性基因，綠色熒光蛋白報告基因。并且保證報告基因和目的基因為非融合型表達。 4.采用電穿孔轉化法轉化牛乳腺上皮細胞，經過G418的初步篩選后，通過熒光顯微鏡觀察到了綠色熒