流感病毒神經(jīng)氨酸酶的結(jié)構(gòu)、耐藥及新型抑制劑作用的機(jī)制研究.pdf

1、流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，四次大流感的暴發(fā)和每年季節(jié)性流感的傳播嚴(yán)重威脅著人類健康并造成重大經(jīng)濟(jì)損失，不時突現(xiàn)的高致病性禽流感時刻警示人類新一輪大流感暴發(fā)的潛在性。由此，流感病毒的不可預(yù)測性及其致病性致使防控流感成為研究的重點與難點。
　　 鑒于疫苗研發(fā)相對滯后，以流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑為代表的抗病毒藥物成為迄今抵抗流感最有效的策略。NA的主要功能是促使新生病毒顆粒釋放并幫助病毒粒子在呼吸道粘液中遷移。A

2、型流感病毒NA的9種亞型依據(jù)一級結(jié)構(gòu)序列可分為兩組：第一組(N1，N4，N5和N8)和第二組(N2，N3，N6，N7，N9)；近期新發(fā)現(xiàn)一種N10亞型，與前兩組NA差異較大。隨著對NA晶體結(jié)構(gòu)的解析和酶活機(jī)制的了解，Zanamivir(Relenzar中文名：瑞樂沙)和Oseltamivir(Tamiflur中文名：達(dá)菲)等靶向NA的競爭性抑制劑被成功設(shè)計并開發(fā)成藥物，這一里程碑式的抗流感藥物研究被視為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的成功范例。

3、r>　　 然而，Zanamivir口服生物利用率低，造成給藥不便；且隨著給藥的增多，Oseltamivir耐藥毒株頻現(xiàn)。這些缺陷使現(xiàn)有藥物的使用面臨瓶頸，新型抑制劑的研發(fā)需求迫切。本文主要利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生化手段開展了以下三方面的工作，為新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑的開發(fā)提供必要的理論依據(jù)：1）解析新型NA蛋白晶體結(jié)構(gòu)；2）系統(tǒng)分析評價新型NA抑制劑的效果并探明其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；3）研究NA對現(xiàn)有藥物的耐藥機(jī)制。
　　 首先，2009甲型H

4、IN1大流感暴發(fā)后，本課題組在第一時間內(nèi)通過桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)及純化了2009大流感病毒典型毒株的神經(jīng)氨酸酶頭部區(qū)域重組蛋白(09N1)，并解析了其晶體結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)09NI（從序列上屬于第一組）缺乏傳統(tǒng)認(rèn)為的第一組NA所特有的150-洞，這對經(jīng)典的NA分組觀點提出了挑戰(zhàn)，因而我們將09N1歸為非典型的第一組NA成員。此后通過結(jié)構(gòu)證明09N1雖不具備150-洞，卻可結(jié)合靶向150-洞的第一組NA特異性抑制劑IG-173，被IG-173“撐

5、開”形成殘缺的150-洞，再次證明了09N1的特殊性。進(jìn)一步對09N1突變體的晶體結(jié)構(gòu)及分子動力學(xué)模擬研究，揭示了09N1的149位氨基酸由Ile（第二組NA常見）突變?yōu)閂al（第一組NA常見）后增加了150-環(huán)鏈的柔性。
　　 其次，近期新型抗流感病毒NA藥物L(fēng)aninamivir(lnavirr)及其前藥CS-8958在日本被批準(zhǔn)使用，CS-8958具有長效保護(hù)機(jī)制，每周僅需一次給藥。我們系統(tǒng)分析評價了蛋白水平下四種NA藥物

6、(Laninamivir,CS-8958，Oseltamivir和Zanamivir)對不同組別NA的抑制活性，主要包括典型的第一組NA(N5)，典型的第二組NA(N2)和非典型的第一組NA(09N1)，并利用X射線晶體衍射手段闡明了四種藥物與NA作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。結(jié)果顯示Laninamivir對各組NA都有很強(qiáng)的抑制能力，且其抑制作用表現(xiàn)出組的偏好性，即對第一組NA的抑制效果更好。同時，我們首次發(fā)現(xiàn)了CS-8958與09N1及N2的作用

7、方式差異明顯，更為重要的是CS-8958/09NI表現(xiàn)出與NA/Oseltamivir類似的結(jié)合模式，這為Oseltamivir與不同組NA結(jié)合和耐受機(jī)制提出了新的視角。這些結(jié)果對Laninamivir及其前藥CS-8958的推廣有指導(dǎo)意義。
　　 另外，我們還對一種新型NA抑制劑MS-257(在Oseltamivircarboxylate骨架基礎(chǔ)上引入了Zanamivir的C4-胍基)對NA的抑制效果和結(jié)合模式進(jìn)行了詳細(xì)分析，

8、MS-257可高效抑制多種流感病毒的NA重組蛋白，且對09NIH274Y突變株效果比Oseltamivir高約8倍，進(jìn)一步探究其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，MS-257的4．胍基比Oseltamivir的4．氨基與NA結(jié)合更緊密，故對09NIH274Y的抑制效果更好。這些結(jié)果為MS-257的進(jìn)一步開發(fā)提供了有利依據(jù)。
　　 此外，為全面系統(tǒng)分析A型流感病毒各種亞型NA的結(jié)構(gòu)和功能特點，預(yù)防潛在的大流感暴發(fā)，本研究還開展了對豬流感毒株N3和高致病性

9、禽流感毒株N7以及新型N10的研究。對N3的序列和結(jié)構(gòu)分析表明，不同于其它第二組NA，N3具有第一組NA特有的Y252殘基，且該殘基被認(rèn)為是致使NIH274Y突變體產(chǎn)生Oseltamivir耐藥的關(guān)鍵因素。而體外活性實驗表明，N3H274Y突變體并未對Oseltamivir產(chǎn)生耐藥。進(jìn)一步解析N3H274Y突變體及其與多種藥物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)了不同于N1突變體的獨(dú)特Y274及W295構(gòu)象。系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)比較揭示了造成這一構(gòu)象差異的兩個

10、關(guān)鍵因素：240-環(huán)鏈，270-環(huán)鏈和290-環(huán)鏈間的氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)弱差異，以及W295與296位氨基酸能否形成開-兀相互作用。據(jù)此，我們提出了NIH274Y突變會導(dǎo)致Oseltamivir耐藥，而N3H274Y突變不會造成Oseltamivir耐藥的全新分子機(jī)制。N7和N10是最后兩個結(jié)構(gòu)未知的A型流感病毒NA，現(xiàn)已成功表達(dá)純化出N7和N10重組蛋白并篩選出蛋白晶體，體外酶活實驗顯示N10無神經(jīng)氨酸酶活性。
　　 總之，本研究