白三烯B4對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性炎癥性自身免疫性疾病，基本病理改變主要是外周關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥及軟骨和骨質(zhì)的破壞。大量研究表明，RA的發(fā)病與初始T輔助細(xì)胞（naive CD4+T cell，Th0）細(xì)胞亞群分化有密切聯(lián)系，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)naiveCD4+T細(xì)胞另外兩種亞型Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞在RA免疫應(yīng)答失衡及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
　　 白三

2、烯B4（leukotriene B4，LTB4）是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧合酶（5-LO）代謝的炎癥介質(zhì)，具有很強(qiáng)的趨化作用和炎癥調(diào)節(jié)作用。在RA患者的滑液中，LTB4的含量明顯升高。LTB4受體阻斷劑或敲除LTB4受體的小鼠，均可阻止關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生。可見(jiàn)LTB4是RA發(fā)病過(guò)程中的重要炎性介質(zhì)。LTB4是否可影響naiveCD4+Tcell向Treg和Th17方向分化，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未有報(bào)道。本研究通過(guò)觀察LTB4對(duì)C57BL/6小鼠脾細(xì)胞n

3、aive CD4+T cell向Treg和Th17細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用；并且在CIA小鼠體外實(shí)驗(yàn)觀察LTB4對(duì)Treg與Th17細(xì)胞的影響；以期進(jìn)一步揭示LTB4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 1 LTB4對(duì)Treg/Th17細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)
　　 方法：
　　 （1）磁珠分選C57BL/6小鼠脾臟CD4+CD62L+naive T細(xì)胞。收集分選后細(xì)胞，種于預(yù)先anti-CD3ε包被的24孔板，加入a

4、nti-CD28、TGF-β1及IL-6，體外誘導(dǎo)CD4+CD62L+naive T細(xì)胞向Th17方向分化；種于預(yù)先anti-CD3ε包被的24孔板，加入anti-CD28及TGF-β1，體外誘導(dǎo)CD4+CD62L+naive T細(xì)胞向Treg方向分化；并觀察轉(zhuǎn)錄因子RORγt及Foxp3時(shí)間依賴性表達(dá)。
　　 （2）LTB4對(duì)naive CD4+T cell向Th17細(xì)胞定向分化的影響。分為四組：對(duì)照組（control組）；L

5、TB4（0.01μM、0.1μM、1μM）組。孵育72小時(shí)，收集細(xì)胞上清，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒檢測(cè)IL-17。孵育48小時(shí)，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)RORγt的mRNA的表達(dá)。
　　 （3）LTB4對(duì)naive CD4+T cell向Treg細(xì)胞定向分化的影響。細(xì)胞孵育72小時(shí)流式細(xì)胞術(shù)觀察CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量，分為五組：同型對(duì)照組；對(duì)照組（control組）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μ

6、M）組。孵育36小時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Foxp3的mRNA的表達(dá)，分為四組：對(duì)照組（control組）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）組。
　　 結(jié)果：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差法（least significant difference，LSD）作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。

7、>　　 （1）經(jīng)磁珠分選后，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD4+CD62L+naive T細(xì)胞純度在90％以上。在抗CD3/CD28存在的條件下，TGF-β1作用3d后可使（10.8667±0.9504）％細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞；在抗CD3/CD28存在的條件下，TGF-β1和IL-6作用3d后IL-17含量（677.8875±87.7284）較對(duì)照組明顯升高（P<0.01），表明誘導(dǎo)成功。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與RORγt mRNA的表達(dá)分別在36

8、h及48h達(dá)到高峰。
　　 （2）LTB4對(duì)naive CD4+T cell向Th17細(xì)胞定向分化的影響。應(yīng)用ELISA法在誘導(dǎo)72h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清IL-17含量，發(fā)現(xiàn)LTB4能劑量依賴性升高IL-17的含量，其中LTB4（0.1、1μM）組（865.4775±88.3310、952.9575±71.7512）較對(duì)照組（677.8875±87.7284）明顯增加（P<0.01）。LTB4在naive T細(xì)胞向Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化

9、48h時(shí)劑量依賴性促進(jìn)了RORγtmRNA的表達(dá)，LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）三個(gè)劑量組（1.1933±0.0321、1.4260±0.0661、1.5180±0.0530）均較對(duì)照組（1.0000±0.0000）明顯升高（P<0.01）。
　　 （3）LTB4對(duì)naive CD4+T cell向Treg細(xì)胞定向分化的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)LTB4在誘導(dǎo)72h時(shí)（0.01、0

10、.1、1μM）能劑量依賴性降低CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量，LTB4三個(gè)劑量組（8.2600±1.1918、6.0330±0.6503、4.1767+1.8029）均較對(duì)照組（10.8667±0.9504）明顯減少（P<0.05）。LTB4在naive T細(xì)胞向Treg細(xì)胞誘導(dǎo)分化36h時(shí)劑量依賴性抑制了Foxp3 mRNA的表達(dá)，其中LTB4（0.1、1μM）組（0.4700±0.0436、0.2000±0.0361）較對(duì)照組（1.

11、0000±0.0000）明顯降低（P<0.01）。
　　 上述結(jié)果顯示LTB4促進(jìn)Th0向Th17細(xì)胞分化，抑制Th0向Treg細(xì)胞分化。
　　 2 LTB4對(duì)CIA小鼠Treg/Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
　　 方法：
　　 （1）建立CIA模型，造模35天對(duì)模型足爪關(guān)節(jié)評(píng)分、觀察關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變及CIA模型DBA/1小鼠脾細(xì)胞中Th17與Treg細(xì)胞的變化。
　　 （2）第28天分離小鼠脾細(xì)胞，

12、體外培養(yǎng)加入CⅡ共同孵育，觀察關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt及Foxp3時(shí)間依賴性表達(dá)。
　　 （3）第28天分離CIA模型DBA/1小鼠脾細(xì)胞，加入CⅡ與不同濃度LTB4共同孵育，體外實(shí)驗(yàn)觀察LTB4對(duì)Th17細(xì)胞的影響。分為四組：對(duì)照組（Control組）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）組。孵育72h，收集細(xì)胞上清，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒檢測(cè)IL-17細(xì)胞因子。孵育36h，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)RORγt的m

13、RNA的表達(dá)。
　　 （4）第28天分離CIA模型DBA/1小鼠脾細(xì)胞，加入CⅡ與不同濃度LTB4共同孵育，體外實(shí)驗(yàn)觀察LTB4對(duì)Treg細(xì)胞的影響。細(xì)胞孵育72h流式觀察CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量，分為五組：同型對(duì)照組；對(duì)照組（Control組）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）組。孵育36h熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Foxp3的mRNA的表達(dá)，分為四組：對(duì)照組（Control組）、LTB4（0.01μM、

14、0.1μM、1μM）組。
　　 結(jié)果：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同前。
　　 （1）CIA模型第35天左右小鼠踝關(guān)節(jié)紅腫及關(guān)節(jié)強(qiáng)直等典型癥狀達(dá)到高峰。組織病理切片：軟骨損傷，滑膜及周圍組織增生，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 CIA小鼠第35天脾細(xì)胞中Th17與Treg細(xì)胞的變化。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清IL-17含量，發(fā)現(xiàn)造模組（19.8484±2.5034）較對(duì)照組（12.1212±3.9190）IL-17含量增加（P<0.05

15、）。熒光定量PCR檢測(cè)RORγt mRNA的表達(dá)，造模組（2.0489±0.1637）較對(duì)照組（1.0000±0.0000）升高（P0.01）。應(yīng)用流式細(xì)胞雙標(biāo)記術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)造模組（0.3266±0.0115）較對(duì)照組（0.4605±0.0275）細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.01）。熒光定量PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA的表達(dá)，造模組（0.4353±0.1267）較對(duì)照組（1.0000±0.0000）

16、明顯降低（P<0.01）。
　　 （2）第28天分離小鼠脾細(xì)胞，體外培養(yǎng)加入CⅡ共同孵育，觀察Th17和Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3mRNA的表達(dá)均在36h達(dá)到高峰。
　　 （3）體外實(shí)驗(yàn)LTB4對(duì)CIA模型DBA/1小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞表達(dá)的影響。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞IL-17含量，發(fā)現(xiàn)LTB4能劑量依賴性增加IL-17含量，其中LTB4（0.1μM、1μM）組（10.6033±3.1954、

17、30.7567±6.0536）較對(duì)照組（3.4767±2.5080）明顯增加（P<0.01）。LTB4劑量依賴性促進(jìn)了RORγt mRNA的表達(dá)，LTB4三個(gè)劑量組（1.3713±0.1352、1.4563±0.1301、1.5773±0.1532）均較對(duì)照組（1.0000±0.0000）明顯升高（P<0.01）。
　　 上述結(jié)果顯示LTB4對(duì)CIA小鼠脾細(xì)胞促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，抑制Treg細(xì)胞分化。
　　 結(jié)論：