新型慢病毒包裝方法及轉(zhuǎn)基因雞生物反應(yīng)器研究.pdf

1、近十幾年來，轉(zhuǎn)基因雞的制備在人們的不懈努力下，取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。這一領(lǐng)域之所以能被人們廣為關(guān)注，不僅僅因?yàn)殡u是一種理想的模式動(dòng)物，更為重要的是轉(zhuǎn)基因雞可以改造成為高效生產(chǎn)人源藥用蛋白的生物反應(yīng)器。禽輸卵管生物反應(yīng)器比傳統(tǒng)工業(yè)反應(yīng)器和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器更加高效而廉價(jià)已經(jīng)成為業(yè)界的共識(shí)。這也使轉(zhuǎn)基因雞的研究成為科研領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)和生物制藥行業(yè)發(fā)展的新方向。
　　由于雞胚胎發(fā)育的特殊性，在轉(zhuǎn)基因雞生物反應(yīng)器的制備中必需使用有別于哺乳

2、類動(dòng)物生物反應(yīng)器的特殊手段。目前看來，使用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞是最可靠的實(shí)驗(yàn)方法。但是由于傳統(tǒng)慢病毒包裝方法的巨大缺陷，以及雞胚注射和后續(xù)篩選中存在的諸多問題，使得成功制備轉(zhuǎn)基因雞生物反應(yīng)器的案例仍然較少被報(bào)道。
　　在本實(shí)驗(yàn)的第一部分中，我們使用了以聚乙烯亞胺(PEI)為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，以聚乙二醇6000(PEG6000)為離心濃縮介質(zhì)的慢病毒生產(chǎn)方法，并對(duì)濃縮后的慢病毒進(jìn)行滴度測(cè)定。此外也對(duì)可能影響慢病毒滴度的幾個(gè)關(guān)鍵因素如轉(zhuǎn)染初

3、始細(xì)胞數(shù)、N/P、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA量、佐劑的選擇等的作用進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在使用15cm培養(yǎng)皿生產(chǎn)慢病毒的條件下，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA總量10.5μg，N/P=20，PEI濃儲(chǔ)液pH7.0-9.0，轉(zhuǎn)染時(shí)293T細(xì)胞數(shù)0.5-2×107時(shí)，可以獲得較好的慢病毒滴度。PEI作為一種新的轉(zhuǎn)染試劑，可以替代磷酸鈣和脂質(zhì)體用于高滴度慢病毒的生產(chǎn)。
　　在第二和第三部分中，我們通過對(duì)現(xiàn)有雞胚開窗注射方法諸多細(xì)節(jié)的不斷優(yōu)化，以及后續(xù)的一系列檢測(cè)

4、手段，最終成功獲得生殖腺嵌合型轉(zhuǎn)基因雞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，通過封口方式、封口膜種類、胚胎穿刺位置、開窗操作時(shí)間、開窗后的液封處理、防止污染的措施等方面的改進(jìn)，我們將開窗注射孵化率提高到了55％。在出雛個(gè)體中，轉(zhuǎn)基因嵌合型個(gè)體所占比例提高到了41.8％。在對(duì)所獲得的31只嵌合體雞進(jìn)一步篩選后，我們最終獲得了4公4母共8只生殖腺嵌合型轉(zhuǎn)基因雞。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明，PEI作為一種新的轉(zhuǎn)染試劑，可以替代磷酸鈣和脂質(zhì)體用于高滴度慢病