利用重組菌不對(duì)稱還原4-氯-乙酰乙酸乙酯.pdf

1、R-(+)-4-氯-3羥基丁酸乙酯(EthylR-4-chloro-3-hydroxybutyrate，(R)-CHBE)是L-肉毒堿、阿伐他汀鈣和(R)-γ-氨基-β-羥基丁酸(GABOB)等多種藥物合成的重要手性中間體，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 由于酶催化還原COBE獲得(R)-CHBE的過(guò)程需要輔酶NADPH參與，為了實(shí)現(xiàn)輔酶再生，本文首先從赭色拋孢酵母細(xì)胞中克隆到了醛基還原酶(NADPH-dependentaldehyder

2、eductase,ALR)基因，并且從巨大芽孢桿菌中克隆出6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，gdh223)基因，構(gòu)建了具有高還原速率和手性選擇性的重組大腸桿菌E.coliM15(pQE30-ALR-gdh223)。優(yōu)化其還原反應(yīng)條件，結(jié)果表明，100g/L重組菌在32℃，以150mM的葡萄糖為輔助底物的緩沖溶液(pH6.0)中能將30mM的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)還原為(R)-

3、CHBE，產(chǎn)物得率為92.5％，對(duì)映體過(guò)量值(e.e.值)為99％。當(dāng)提高底物濃度達(dá)到90mM時(shí)，發(fā)現(xiàn)單相反應(yīng)過(guò)程存在比較嚴(yán)重的底物抑制，產(chǎn)率降為30％。底物分批加入可以部分解除底物抑制，但產(chǎn)物抑制作用仍然存在。 為減輕產(chǎn)物抑制的影響，研究了重組菌在兩相體系中不對(duì)稱還原反應(yīng)，并優(yōu)化其還原反應(yīng)條件。結(jié)果表明，在水/乙酸丁酯兩相體積為1：1的體系中，32℃時(shí)在添加150mM葡萄糖的緩沖溶液中，反應(yīng)時(shí)間為4h，100g/L的重組菌能將

4、90mM的COBE還原為(R)-CHBE，產(chǎn)物得率為74％，e.e.值為99％，明顯高于水相的30％。 此外，還研究了在水/乙酸丁酯兩相體系中，利用能分別表達(dá)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組菌M15(pQE30-ALR)和重組菌M15(pQE30-gdh223)進(jìn)行雙菌耦合不對(duì)稱還原的反應(yīng)條件。結(jié)果表明，在水/乙酸丁酯的體系中，32℃時(shí)在pH6.0的緩沖溶液中，100g/L的重組菌(M15(pQE30-ALR)/M15(pQE30