基底硬度及細(xì)胞密度對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨分化的影響及機(jī)理研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）作為成體干細(xì)胞中最重要的一種，是一類具有多向分化潛能（Multiple differentiation potentiality）的細(xì)胞，能夠向神經(jīng)細(xì)胞，肌細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等方向分化。因其多向分化的能力MSCs已成為組織再生、修復(fù)的重要種子細(xì)胞來源。目前的再生醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為MSCs在心肌細(xì)胞受損后、脊髓損傷、骨損傷等組織修復(fù)和再生工程中發(fā)揮重要

2、作用。然而，組織修復(fù)與再生研究中所用的生物材料的物理特性及細(xì)胞周圍微環(huán)境，尤其是基底硬度對MSCs定向分化方面的作用機(jī)理，至今仍不明了。
　　在組織修復(fù)與再生研究中，MSCs的定向誘導(dǎo)分化尤為重要，研究證明在復(fù)雜的組織微環(huán)境中，影響MSCs分化的因素不僅包括被廣泛研究的生物化學(xué)因素，還包括傳導(dǎo)力學(xué)信號的生物物理因素。不同的基底材料硬度（Matrix stiffness）和接種的細(xì)胞密度（Cell density）是否會調(diào)節(jié)MSCs

3、分化以及如何影響其分化尚不清楚。本文著重研究基質(zhì)硬度對MSCs向成骨和軟骨分化的影響，在此基礎(chǔ)上探討不同細(xì)胞密度對其分化的影響，繼而研究哪條信號通路在基底硬度誘導(dǎo)MSCs向成骨分化過程中起主要調(diào)控作用。本文的主要研究工作和結(jié)果如下：
　　1. MSCs細(xì)胞形態(tài)和增殖對基底硬度及細(xì)胞密度的響應(yīng)通過改變丙烯酰胺（Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide）的比例，使材料物理硬度控制在約0.5至100千帕之間。

4、軟基底上MSCs貼壁面積僅為硬基底上的40％且應(yīng)力纖維少而弱。細(xì)胞在軟硬凝膠上以低密度（1,000個/cm2）和高密度（20,000個/cm2）培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在低密度培養(yǎng)時，軟基底顯著抑制MSCs的增殖速度，且在軟基底上P-Rb, P-P70顯著降低，P27顯著升高；高密度培養(yǎng)時，軟硬基底對細(xì)胞增殖造成的差異消失。以上實(shí)驗(yàn)說明細(xì)胞增殖與基底硬度有關(guān)，但在高密度培養(yǎng)時，基底硬度對細(xì)胞增殖的影響消失，軟硬基底上的細(xì)胞增殖沒有顯著差異。

5、r>　　2.基底硬度和細(xì)胞密度對MSCs成骨和軟骨分化的影響成骨分化的標(biāo)記基因Alkaline Phosphatase(ALP), Type I collagen, alpha1(Col1α1)，Runt-related transcription factor2(Runx2)在硬基底（Hard,40±3.6 kPa）上mRNA水平明顯升高，表明單純的物理刺激即基底硬度就能促進(jìn)MSCs的成骨分化,在骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中也同樣得到以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

6、另外軟骨分化的標(biāo)記基因SOX-9(SRY-related high mobility group-box gene9)，Aggrecan，Collagen II和Collagen X的mRNA水平在軟基底（1.6±0.3 kPa）上顯著升高，SOX9的蛋白表達(dá)在軟基底上明顯升高，Alcian blue染色和Collagen II免疫熒光染色結(jié)果均顯示軟基底更有利于軟骨分化。對成骨分化而言，高密度（20,000個/cm2）培養(yǎng)時成骨分化的

7、標(biāo)記基因ALP、Col1α1和Runx2的mRNA水平在軟硬基底上無明顯差異；而軟骨分化則不受細(xì)胞密度的影響，無論高（20,000個/cm2）、低密度（1,000個/cm2）培養(yǎng)MSCs，SOX-9，Aggrecan和Collagen X的mRNA水平均在軟基底上明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在組織工程應(yīng)用中，低密度和硬基底培養(yǎng)有利于促進(jìn)MSCs向成骨分化；軟基底培養(yǎng)則有利于促進(jìn)軟骨分化，且此過程與細(xì)胞密度無關(guān)。
　　3.不同硬度基底上

8、RhoA和Rho-kinase(ROCK)及微管抑制劑對MSCs的影響通過對MSCs轉(zhuǎn)染RhoAV14(constitutively active form of RhoA with GST tag)、加入Rho激酶特異性抑制劑Y-27632及微管抑制劑Paclitaxel，觀察MSCs細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性和成骨標(biāo)記基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RhoAV14刺激ERK磷酸化增強(qiáng)，促進(jìn)MSCs增殖且上調(diào)軟基底上成骨標(biāo)記基因的表達(dá)

9、。Y-27632影響細(xì)胞粘附，F(xiàn)-actin由中間均勻分布變?yōu)橹虚g熒光微弱，僅有邊緣熒光，同時Y-27632降低成骨分化標(biāo)記基因的表達(dá)，上調(diào)軟基底上神經(jīng)元分化標(biāo)記β3tubulin(TUBβ3)基因的表達(dá)。Paclitaxel作用后軟硬基底上細(xì)胞增殖差異消失；細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn)軟基底上的細(xì)胞凋亡明顯多于硬基底；檢測Paclitaxel作用后成骨標(biāo)記基因Runx2和神經(jīng)分化標(biāo)記基因TUBβ3，發(fā)現(xiàn)軟基底上的Runx2明顯受抑制，而硬基底上的

10、Runx2抑制作用沒有顯著差異，TUBβ3加藥組與對照組沒有明顯差異。綜上，我們認(rèn)為軟硬基底調(diào)節(jié)的細(xì)胞分化過程中存在細(xì)胞骨架如微絲、微管以及RhoA和ROCK的參與。
　　4. Smad1/5/8，ERK和AKT的活化通路參與硬基底促進(jìn)的MSCs成骨分化過程為研究基底硬基底誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，對MSCs成骨分化調(diào)節(jié)相關(guān)信號因子進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)硬基底在促進(jìn)MSCs成骨分化的過程中激活Smad1/5/8，ERK，AKT蛋

11、白的磷酸化，抑制P-38蛋白的磷酸化。而軟基底促進(jìn)軟骨分化的過程中未檢測到Smad1/5/8，AKT/ERK的磷酸化差異。分析以上結(jié)果推測Smad1/5/8、ERK和AKT的磷酸化在基底硬度調(diào)節(jié)的MSCs成骨分化中起關(guān)鍵作用，而軟骨分化則是利用其他不同于成骨分化的通路。進(jìn)一步利用重組腺病毒RasV12和RasN17分別外源性的激活和抑制ERK/AKT的磷酸化。結(jié)果RasN17能明顯抑制ERK/AKT和Smad1/5/8的磷酸化；而Ras

12、V12只能刺激ERK的磷酸化，對AKT和Smad1/5/8的磷酸化作用不明顯。腺病毒感染后的結(jié)果顯示RasN17能顯著抑制成骨分化的標(biāo)志基因ALP，Col1α1和Runx2的mRNA水平。相反RasV12雖然能激活ERK磷酸化卻并沒有促進(jìn)成骨分化的作用。提示基底硬度決定的細(xì)胞成骨分化機(jī)理除Ras-Smad1/5/8和ERK/AKT這條通路外應(yīng)該還存在其他通路參與。
　　綜上所述，本文利用可調(diào)節(jié)力學(xué)特性的聚丙烯酰胺水凝膠模型培養(yǎng)MS

13、Cs，通過接種在不同的硬度基底上以及接種密度差異對比研究MSCs的成骨和軟骨分化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架、RhoA-ROCK參與其中，以及硬基底決定的成骨分化中關(guān)鍵信號通路Ras-Smad1/5/8/ERK/AKT。實(shí)驗(yàn)表明MSCs成骨及軟骨分化方向的不同依賴于基底硬度和細(xì)胞密度對其的影響。進(jìn)一步說明跟分化方向特異性相關(guān)的細(xì)胞外微環(huán)境因素有利于控制干細(xì)胞分化方向，從而可以調(diào)控細(xì)胞向需要的方向分化，為MSCs在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)