WIG-1在食管癌組織及人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109中的表達(dá)及其臨床意義研究.pdf

1、背景
　　食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近些年來(lái)發(fā)病率有所上升,與其他惡性腫瘤相比其預(yù)后較差,糾其主要原因就是門部分食管癌在早期就己經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移。近年來(lái),基因治療成為腫瘤治療方面的一大熱點(diǎn),有可能成為未來(lái)治療腫瘤的一個(gè)有效手段,對(duì)于食管癌來(lái)說(shuō),基因?qū)哟蔚难芯枯^其他腫瘤來(lái)說(shuō)還比較少,因此尋找一個(gè)在食管癌發(fā)生、移轉(zhuǎn)中能夠起到關(guān)鍵作用的分子就顯得比較迫切[1]。WIG-1(wild-type p53-induced gene1

2、,野生型p53誘導(dǎo)基因1)是一種由p53基因誘導(dǎo)表達(dá)的鋅指蛋白,與雙鏈 RNA結(jié)合后,能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,因此有可能是食管癌的一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)分析WIG-1在不同食管癌組織的表水平達(dá)差異,得到其與食管癌患者的預(yù)后可能存在的關(guān)系;并通過(guò)構(gòu)建WIG-1不同表達(dá)水平的人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109,來(lái)進(jìn)一步探討WIG-1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞主要的生物學(xué)行為方面的影響以及可能的作用機(jī)制,并進(jìn)一步篩選出WIG-1可能的作用分子

3、,可望為食管癌的基因治療方面提供一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　目的
　　制備WIG-1單克隆抗體,為進(jìn)一步的研究工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。了解WIG-1不同的表達(dá)水平與食管癌患者臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系;構(gòu)建WIG-1高表達(dá)與低表達(dá)的人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109,從而可以進(jìn)一步研究WIG-1基因?qū)τ贓C109細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡以及侵襲等生物學(xué)行為的影響;探討 WIG-1對(duì) EC109細(xì)胞的化療藥物敏感性、化療藥物的耐藥性以及對(duì)細(xì)胞損傷、修復(fù)

4、等能力的影響,并提出其可能的分子機(jī)制;通過(guò)WIG-1對(duì)基因表達(dá)譜的影響來(lái)篩選出其可能的作用分子。
　　方法
　　應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制WIG-1單克隆抗體;
　　應(yīng)用RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)食管癌組織及其對(duì)應(yīng)近癌、遠(yuǎn)癌組織中WIG-1基因的表達(dá);
　　應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建了 WIG-1基因高表達(dá)與低表達(dá)的人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109,并用RT-PCR和Western blot技術(shù)進(jìn)行鑒定;
　　應(yīng)用MTT

5、實(shí)驗(yàn)繪制WIG-1基因不同表達(dá)水平的EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;
　　應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀技術(shù)以及DNA斷裂實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WIG-1基因不同表達(dá)水平的EC109細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化;
　　應(yīng)用Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞損傷刮擦試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)WIG-1基因不同表達(dá)水平對(duì)人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109侵襲活性的影響;
　　應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外藥物敏感性分析,計(jì)算細(xì)胞對(duì)藥物的IC50值;

6、　　應(yīng)用Western Blot檢測(cè)WIG-1基因的不同表達(dá)水平對(duì)部分耐藥分子表達(dá)水平的影響;
　　應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè) WIG-1基因不同表達(dá)水平對(duì)于由紫外線照射造成的不同的DNA損傷情況及修復(fù)能力;
　　10、應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)WIG-1基因?qū)C109細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響;
　　11、就用酵母雙雜交技術(shù)篩選出WIG-1基因可能的作用分子。
　　結(jié)果
　　1、成功制備了WIG-1單克隆抗體,并通

7、過(guò)Western Blot及免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí);
　　2、WIG-1基因在食管癌腫瘤的不同部位的標(biāo)本中存在差異性表達(dá),食管癌組織中WIG-1基因的表達(dá)水平明顯低于近癌及遠(yuǎn)癌組織,而近癌組織則顯著低于遠(yuǎn)癌組織(p<0.05);
　　成功構(gòu)建了WIG-1基因高表達(dá)及低表達(dá)的人源性食管鱗癌細(xì)胞株EC109,并通過(guò)半定量RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí);
　　MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、DNA斷裂實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀技

8、術(shù)、Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞損傷刮擦實(shí)驗(yàn)等的結(jié)果表示,WIG-1基因的高表達(dá)可以抑制EC109細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,并能夠顯著降低人源性食管鱗癌細(xì)胞系EC109的侵襲、移動(dòng)能力;
　　5、WIG-1基因的高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)EC109細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑(CDDP)、阿霉素(ADR)等化療藥物的敏感性,對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)的敏感性,則無(wú)明顯影響,WIG-1基因可能通過(guò)抑制ERCC1及P-gp的表達(dá)進(jìn)而

9、提高EC109細(xì)胞對(duì)于化療藥物的敏感性,降低EC109細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性;
　　6、WIG-1基因的高表達(dá)能夠減少紫外線照射對(duì)EC109細(xì)胞的DNA損傷效應(yīng),并顯著增強(qiáng)EC109細(xì)胞的DNA修復(fù)能力;
　　7、基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明,上調(diào)WIG-1基因的表達(dá)水平可以影響419種基因的表達(dá),而上調(diào)WIG-1基因的表達(dá)水平可能影響301種基因的表達(dá);
　　8、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出WIG-1基因的可能作用分子為:ILF

10、3(NM_017620), UTP14A(NM_006649),Sox3(NM_005634)。
　　結(jié)論
　　制備了WIG-1單克隆抗體,為本實(shí)驗(yàn)研究以及進(jìn)一步的深入研究奠定了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。并構(gòu)建了WIG-1基因高表達(dá)及低表達(dá)的人源性食管鱗癌細(xì)胞株EC109。WIG-1基因不僅在食管癌組織細(xì)胞中有表達(dá),且在正常的組織細(xì)胞中亦有表達(dá),其食管癌組織中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)應(yīng)近癌及遠(yuǎn)癌組織;WIG-1基因的高表達(dá)可以抑制EC10

11、9細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,而 WIG-1基因的低表達(dá)可以促進(jìn) EC109細(xì)胞增殖,抑制其凋亡;WIG-1表達(dá)水平增高可以抑制ERCC1和P-gp的表達(dá),進(jìn)而提高EC109細(xì)胞對(duì)于化療藥物的敏感性,而WIG-1表達(dá)水平下降時(shí),結(jié)果恰恰恰相反;WIG-1基因高表達(dá)可以增強(qiáng)EC109細(xì)胞的紫外線耐受性及DNA修復(fù)能力;上調(diào)或下調(diào)WIG-1基因表達(dá)水平可以影響多種基因的表達(dá),希望在進(jìn)一步的研究中可以探尋到 WIG-1基因,作為一個(gè)己知抑癌基因的