黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵工藝優(yōu)化及酶學特性研究.pdf

1、糖化酶是研究與開發(fā)最早的酶類之一。早在上世紀50年代我國上海便開始工業(yè)化生產(chǎn)糖化劑，在之后的30年中迅速發(fā)展，成為酶制劑工業(yè)的支柱產(chǎn)品，廣泛應用于釀造業(yè)、制糖業(yè)、食品加工業(yè)及抗菌素、有機酸、氨基酸等發(fā)酵工業(yè)和輕工紡織業(yè)，是世界上產(chǎn)量最大和用途最廣的酶類。然而，近30年來，糖化酶生產(chǎn)幾乎成為一個被遺忘的角落，很少有人繼續(xù)從事這一課題的研究，致使菌種退化，產(chǎn)量下降，技術(shù)水平停滯不前。
　　本文以該黑曲霉突變菌株IN7-31為材料，采用

2、正交的方法分別對固態(tài)發(fā)酵的營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件進行了正交優(yōu)化，營養(yǎng)條件選取了玉米粉、麩皮、(NH4)2SO4、K2HPO44個因素，培養(yǎng)條件選取了溫度、發(fā)酵天數(shù)、料/水、接種量4個因素，每組每個因素取3個水平，進行試驗L27(313)，確定該菌株產(chǎn)糖化酶最佳生產(chǎn)工藝。結(jié)果表明，最佳工藝為麩皮∶玉米粉:1∶2;(NH4)2SO4:2％; K2HPO4:0.3％;溫度:30℃;發(fā)酵天數(shù):5d;料/水:25％;接種量:3％。在最佳生產(chǎn)工藝下，該

3、菌株產(chǎn)糖化酶的活力為17203U/g，比原始培養(yǎng)基提高了79％。本文研究結(jié)果表明，本研究可以為糖化酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一些發(fā)酵工藝參數(shù)。
　　同時，本文還采用響應面法分別對該菌株產(chǎn)糖化酶的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。首先，采用最陡爬坡實驗，用最陡爬坡試驗逼近最大響應區(qū)域，再通過中心組合實驗及響應面法分析優(yōu)化了這幾個因素，并進行了優(yōu)化后的驗證實驗。利用SAS軟件分析得到該菌株產(chǎn)糖化酶的最佳培養(yǎng)基配方和工藝條件為:玉米粉56

4、.5 g/L，豆粉22.0 g/L，K2 HPO41.3 g/L，pH6.40，裝液量80.8mL/250 mL三角瓶，在此條件下在搖瓶發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)糖化酶的最大酶活力為3044U/mL，比優(yōu)化前提高了1.59倍。通過應用優(yōu)化后的技術(shù)參數(shù)進行了10L發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵液糖化酶活力達到了3412U/mL，達到國內(nèi)先進水平。結(jié)果表明，通過響應面試驗得到了產(chǎn)糖化酶黑曲霉液態(tài)發(fā)酵最佳工藝條件，本研究可以為液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支

5、持。
　　本論文還對該菌種產(chǎn)糖化酶的酶學特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其糖化酶的最適反應溫度為50℃，在40～60℃下酶活性均較高。該酶處于30～45℃下，酶對溫度的穩(wěn)定性較好;在不同pH的緩沖液中測定該酶的活性，結(jié)果表明該酶的最適pH為5.0，在pH5.5～7.0之間具有較好的穩(wěn)定性;Fe2+、Cu2+對酶活力具有較強的抑制作用，Zn2+、Mg2+、Ca2+對酶活力比較弱的抑制作用，EDTA對該糖化酶具有較強的促進作用，該酶可以作為進一步