轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻的構(gòu)建和自絮凝斜生柵藻細(xì)胞絮凝的研究.pdf

1、微藻可以用于CO2減排、污水處理和生物能源生產(chǎn)，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。但由于微藻細(xì)胞個(gè)體小，表面攜帶電荷以及培養(yǎng)濃度低等特點(diǎn)，使得微藻采收成本高居不下。理想的微藻不但應(yīng)有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，最好還具有細(xì)胞絮凝能力，利用其細(xì)胞絮凝特性進(jìn)行采收，會(huì)大大降低采收成本。
　　斜生柵藻不但可以作為飼料餌料，也可用于水體修復(fù)，還可用于生物柴油生產(chǎn)。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究還很少，缺少高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。本文以斜生柵藻FS

2、P-3為實(shí)驗(yàn)材料，建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn)了酵母絮凝基因的成功表達(dá)，并證明了酵母絮凝基因可賦予柵藻細(xì)胞絮凝的特性。此外，還研究了天然自絮凝柵藻AS-6-1的細(xì)胞自絮凝特性，探討了細(xì)胞自絮凝機(jī)理，研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　首先，對(duì)實(shí)驗(yàn)藻株進(jìn)行無(wú)菌處理，這是進(jìn)行微藻生理、生化以及遺傳學(xué)研究的關(guān)鍵和前提。通過(guò)離心洗滌和稀釋平板法除去藻液中的霉菌，再利用溶菌酶/SDS并結(jié)合抗生素法除藻液中的細(xì)菌，通過(guò)鏡檢及無(wú)菌檢驗(yàn)，未見(jiàn)有細(xì)菌或霉菌存

3、在，證明有效地去除了斜生柵藻FSP-3和AS-6-1中的雜菌，為后續(xù)研究工作提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。在此基礎(chǔ)上，對(duì)獲得的無(wú)菌藻株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，分別考察了接種量、溫度、表面光照強(qiáng)度及初始pH對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。斜生柵藻FSP-3的最適培養(yǎng)條件為1×106cells/mL的接種量，28℃培養(yǎng)，6000 lx的光照強(qiáng)度和初始pH為6.0-6.5;而斜生柵藻AS-6-1最適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件為:1×106 cells/mL的接種量，30℃培養(yǎng)

4、，6000lx的光照強(qiáng)度和pH為6.5的初始pH。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，斜生柵藻FSP-3和AS-6-1的生長(zhǎng)情況均得到了明顯的改善，不但生物量積累增加，而且多糖、蛋白質(zhì)、總脂等胞內(nèi)組分的含量也顯著地提高。
　　以游離斜生柵藻FSP-3細(xì)胞為受體，采用電擊法將含有CaMV35S啟動(dòng)子、報(bào)告基因gfp、選擇標(biāo)記基因cat的載體pCAMB IA1302-CAT導(dǎo)入藻細(xì)胞中，并對(duì)電擊轉(zhuǎn)化的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在質(zhì)粒濃度為50μg/

5、mL，滲透液濃度為0.2 mol/L，脈沖時(shí)間為2 ms，脈沖電壓為2 kV的條件對(duì)斜生柵藻FSP-3進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)494±48/106受體細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定傳代10個(gè)月，得到的轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性是目前微藻遺傳轉(zhuǎn)化研究中較高水平。進(jìn)而，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別定性和定量檢測(cè)報(bào)告基因gfp在轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)，證明所選用的載體元件包括啟動(dòng)子CaMV35S、報(bào)告基因gfp、選擇標(biāo)記基因cat在斜生柵藻FSP-3遺傳轉(zhuǎn)化體系

6、中均有效可用。同時(shí)采用PCR，Southern blot以及RT-PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了分析，從DNA和RNA水平上證明了載體pCAMBIA1302-CAT成功地導(dǎo)入斜生柵藻FSP-3細(xì)胞中，并將T-Border之間的區(qū)域隨機(jī)整合到柵藻FSP-3基因組中。由此建立了斜生柵藻FSP-3高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并為外源基因的導(dǎo)入奠定基礎(chǔ)。
　　將含有酵母絮凝基因FLO1的表達(dá)載體pCAMBIA1302-CAT-FLO1導(dǎo)入斜生柵藻F

7、SP-3細(xì)胞中，篩選得到具有絮凝性狀的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)熒光顯微鏡和掃描電鏡從細(xì)胞水平上觀察到由于酵母絮凝基因FLO1的導(dǎo)入，引起了藻細(xì)胞絮凝的現(xiàn)象。利用PCR、RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了分析，證明了酵母絮凝基因FLO1成功導(dǎo)入斜生柵藻FSP-3細(xì)胞中并進(jìn)行了有效地表達(dá)，從而賦予了轉(zhuǎn)化子細(xì)胞絮凝的特性。通過(guò)轉(zhuǎn)基因藻株與野生型藻株的生長(zhǎng)代謝情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入表達(dá)對(duì)柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)的并不顯著。由此證明酵母的絮凝基因可在微藻中進(jìn)行表

8、達(dá)，并賦予微藻自絮凝性狀。
　　通過(guò)比較天然自絮凝斜生柵藻AS-6-1和轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻FSP-3-FLO1，發(fā)現(xiàn)二者絮凝形態(tài)和絮凝性能存在較大差異:轉(zhuǎn)基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝顆粒較大，表現(xiàn)出良好的自沉降性能，而天然絮凝微藻AS-6-1對(duì)淡水游離藻柵藻FSP-3和小球藻CNW-11具有良好的絮凝沉降能力。另外，天然自絮凝藻AS-6-1絮凝性能具有良好的溫度耐受性和pH穩(wěn)定性，而且不受金屬離子螯合劑EDTA和糖的影響，具

9、體原因與其絮凝活性物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。轉(zhuǎn)基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝性能表現(xiàn)出高溫和pH的敏感性，被EDTA、蛋白酶K解絮以及被甘露糖、半乳糖抑制的現(xiàn)象，其原因歸結(jié)為轉(zhuǎn)基因柵藻FSP-3-FLO1的絮凝性狀是由于表達(dá)了外源酵母絮凝蛋白而引起的，絮凝蛋白的穩(wěn)定性和活性直接影響了其細(xì)胞絮凝的性狀。
　　研究表明天然自絮凝斜生柵藻AS-6-1的絮凝活性物質(zhì)是多糖，其中中性糖、酸性糖和氨基糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為16∶9∶1，單糖組成中較高的甘