柑橘衰退病毒S45分離物的分子特點(diǎn)及蚜蟲傳播對(duì)CTV分子變種組成的影響.pdf

1、柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)在世界各柑橘產(chǎn)區(qū)均有分布,且存在株系分化,主要有莖陷點(diǎn)株系、速衰株系及苗黃株系,其中速衰株系在以酸橙為砧木的柑橘上可引起樹體的衰退,莖陷點(diǎn)株系引起葡萄柚和某些甜橙品種的莖陷點(diǎn)癥狀,病株果實(shí)變小、產(chǎn)量與品質(zhì)降低,因此對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。CTV是長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)長(zhǎng)線形病毒屬(Closterovirus)成員,其基因組為全長(zhǎng)約19.3 kb的

2、+ssRNA,為已知基因組最大的植物病毒。目前全世界已報(bào)道有15個(gè)CTV分離物的全基因組序列,根據(jù)各分離物的基因組序列特點(diǎn),可劃分為5種基因型,即T30、VT、T36、T3和B165。為更深入了解我國(guó)發(fā)生的CTV的群體結(jié)構(gòu)及分子特點(diǎn),本研究選取了具有高度變異的CTV分離物S45為主要研究對(duì)象,對(duì)其分子變異特性進(jìn)行了研究,同時(shí)分析了蚜蟲傳播對(duì)分離物Z5的分子變種組成的影響,結(jié)果如下。
　　 1.根據(jù)已報(bào)道的CTV基因組結(jié)構(gòu)及序列設(shè)

3、計(jì)引物,采用RT-PCR技術(shù)對(duì)CTV分離物S45的全基因組分片段進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了克隆,選取各擴(kuò)增片段的克隆9-16個(gè),采用PCR-SSCP方法進(jìn)行分析的結(jié)果顯示,該CTV分離物是由多個(gè)分子變種組成的群體,各擴(kuò)增片段均含有多種SSCP單體型,其單體型組成從2-6種不等。選取表現(xiàn)出不同SSCP帶型的克隆進(jìn)行測(cè)序,序列比對(duì)的結(jié)果顯示,所擴(kuò)增的各區(qū)域均存在一定分子變異,其中M2區(qū)域變異最大,克隆間的遺傳距離為0.255±0.019。

4、變異相對(duì)較小的是P27區(qū)域,克隆間的遺傳距離為0.033±0.007,而CP基因的變異很小,所測(cè)序的6個(gè)克隆間僅有2-4個(gè)堿基差異,遺傳距離為0.003±0.002。各克隆片段的序列與已報(bào)道的CTV分離物的序列比對(duì)分析的結(jié)果顯示,該分離物基因組的部分區(qū)域同時(shí)存在與弱毒株系T30及強(qiáng)毒株系NZRB-G90具有較高序列相似性的分子變種,部分克隆則與二者的序列相似性均相對(duì)較低,推測(cè)可能存在兩個(gè)株系間的重組。
　　 2.將相鄰片段所測(cè)得

5、的多個(gè)分子變種序列進(jìn)行拼接,獲得一個(gè)全長(zhǎng)為19243 nt的基因組序列(命名為S45-R)。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明,S45-R與GenBank上已登錄的15個(gè)分離物的基因組全長(zhǎng)序列相似性為80.0％-93.5％,與弱毒株系T30核苷酸序列相似性最高,為93.5％；但其CP基因與強(qiáng)毒株系NZRB—G90相似性最高,為97.2％,與T30為93.30％；P23蛋白在強(qiáng)弱毒株系鑒定的氨基酸位點(diǎn)則顯示出與弱毒株系一致的特點(diǎn),該結(jié)果進(jìn)一步表明CT

6、V分離物S45基因組內(nèi)存在重組現(xiàn)象。采用RDP重組分析軟件包對(duì)S45-R進(jìn)行重組分析,發(fā)現(xiàn)所獲全長(zhǎng)序列內(nèi)存在8個(gè)潛在的重組區(qū)域,各重組區(qū)域均被3種或3種以上方法檢測(cè)到。其中RDP軟件包的7種分析方法均從位于11483-13744 nt區(qū)域(位于P33、P6和P653個(gè)基因內(nèi))檢測(cè)到重組事件,且均為極顯著(P值從1.216×10-148到8.315×10-27),其主要親本和次要親本分別為弱毒株系T30和強(qiáng)毒株系NZRB-G90。

7、　　 3.采用RT-PCR方法對(duì)本研究室保存的7個(gè)CTV分離物的CP基因進(jìn)行擴(kuò)增,選取擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR-SSCP分析,結(jié)果顯示分離物N4、N9和N25的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為單一的SSCP單體型,N3、N21、Z30的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為3種單體型組成的混合群體,Z5的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為7種單體型組成的混合群體,即分離物內(nèi)存在多個(gè)分子變種的混合侵染。選取種群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的分離物Z5為毒源,采用棉蚜對(duì)20株甜橙實(shí)生苗進(jìn)行傳毒,約3個(gè)月后進(jìn)行病