皮膚組織生物力學和生物化學時序性變化推斷死亡時間.pdf

1、背景與目的：
　　死亡時間(Postmortem Interval,PMI)指從機體死亡至尸檢時的間隔時間。PMI的推斷可大致分為早期、晚期和白骨化推斷三個階段,由于存在諸多難以避免的人為及外界環(huán)境等因素的影響,死亡時間難以準確推斷。準確地推斷PMI,對于殺人案件的刑事偵查,及其他案件均具有重要的證據價值,推斷PMI至今仍是法醫(yī)鑒定工作的重點和難點問題。隨著醫(yī)學科學技術的快速發(fā)展,推斷PMI的手段從早期主要依靠尸體現象,發(fā)展到現在

2、綜合利用生物物理學、生物化學、免疫組織化學、分子生物學等技術手段。但迄今,尚無公認的準確可靠、簡單易行的推斷PMI方法。
　　生物力學(biomechanics)是應用力學原理和方法進行生物組織力學方面定量研究的物理學分支,已在醫(yī)學領域應用廣泛,形成了專門的醫(yī)學生物力學,其在法醫(yī)學領域的應用主要集中在機械性損傷的力學機制研究。尚未見應用生物力學手段推斷死亡時間的系統(tǒng)研究。
　　本課題組前期基于尸體自溶腐敗過程中,組織的生物化

3、學降解必然導致其形態(tài)結構改變,而組織結構改變又必然導致其生物力學性狀改變的本構關系或構效關系原理,先后以大鼠和家豬軟組織為研究對象,初步證實了尸體組織器官生物力學性狀隨死亡時間延長的時序性變化和其推斷PMI的可行性。
　　本實驗在課題組前期研究基礎上,同步應用生物力學和生物化學的理論和技術,探討了皮膚組織生物力學性狀和固定-萃取液生物化學物質含量的時序性變化規(guī)律,及其與PMI的相關性。同時,觀察皮膚組織大體形態(tài)、組織結構,應用計算

4、機顯微病理圖像處理技術,量化分析皮膚組織形態(tài)結構與生物力學性狀變化的構效關系,期望為法醫(yī)學推斷PMI提供新的理論依據和技術方法。
　　材料與方法：
　　1、實驗動物5頭4月齡閹割成年家豬(太湖豬種,汕頭屠宰場),平均體重150kg,常規(guī)主動脈放血屠宰后,立即切取胸腹部平整區(qū)域的皮膚組織,放置25℃濕度70％±5%恒溫恒濕人工氣候箱保存。
　　2、取材規(guī)范時間組:從氣候箱保存時間算起,按0h、24h、48h、72h、96

5、、120h、144h、168h、192、216、240h、264h分12個時間組,5頭/組。
　　遵循“六定”原則:
　　①定時。按分組時間點取材,每頭家豬每個時間點取4塊組織試件。
　?、诙ㄏ蚨ㄎ?。統(tǒng)一平行皮紋方向,切取5cm×1.5cm厚薄較均勻的矩形胸腹部皮膚組織樣本。
　?、鄱ㄒ憾ū?。蒸餾水與甲醛原液9:1配制10%甲醛溶液固定液,試件質量與固定液體積比1:10固定組織試件,密閉避光固定72h后取出組織試

6、件,進一步處理等待上機測試。
　?、芏ㄐ?。上機測試前,用游標卡尺測量,將試件切成4cm×1cm標準試件,控制厚度3mm±0.5mm,福爾馬林浸濕紗布保濕,上機檢測。
　　3、組織形態(tài)學觀測
　?、糯篌w觀察和記錄各時間點的家豬皮膚組織的色澤、質地、形態(tài)、氣味等變化情況。在自制固定光源照度箱內,采用數碼相機1400萬像素拍照皮膚表面照片,應用Photoshop CS5讀取各樣本照片RGB值。
　?、茀⒖忌锪W性狀參

7、數選擇差異顯著的4個時間段內0h,48h,72h,144h,168h,192h,216h,264h等8個時間組,備制皮膚組織石蠟切片,常規(guī)HE染色和膠原-網狀-彈力纖維三聯染色,使用Leica Application Suite Version 4.0.0圖像分析系統(tǒng),觀測各時間點的皮膚組織形態(tài)結構,并拍攝光鏡顯微組織照片,采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像量化分析軟件,校準標尺空間后,特殊染色分析設定histogram

8、based\RGB(R門檻值為103,G門檻值為193,B門檻值均為211),20倍視野下,計算膠原纖維總面積、彈性纖維總面積、平均膠原纖維直徑,以及非膠原纖維總面積等指標。
　　4、生物力學實驗
　　采用WDT-Ⅲ電子萬能材料試驗機,進行拉伸測試,室溫下,20mm/min勻速單軸拉伸測試,測試前進行10次預調試,預調間隔約30s。主要檢測記錄極限載荷、極限載荷變性,斷裂力、平均力等指標。同時,觀察試件大體形態(tài)變化。生物力學

9、實驗完成后選取部分試件備制常規(guī)HE染色切片、膠原纖維染色,進行組織形態(tài)學觀察,顯微圖像處理量化分析皮膚組織膠原、膠原纖維空隙面積等指標。
　　5、生物化學檢測
　?、盘崛〗M織試件后,使用濾紙將組織固定-萃取液過濾到50mlEP管內,pH計檢測pH值;
　　⑵提取4.0ml上清液,5000轉離心處理后用紫外-可見光分光光度儀進行色度檢測;
　?、翘崛∩锨逡?.5ml,茚三酮染色后,用紫外-可見光分光光度儀檢測其蛋白

10、質及其降解物含量。
　　6、實驗數據統(tǒng)計處理
　　采用excel、SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所得數據進行分析,各組數值以均數±標準差(`x±s)表示,采用獨立樣本t檢驗及單向方差分析(One-way ANONA),統(tǒng)計學檢驗的顯著性水平定義為:P<0.05為差異有顯著性。
　　結果：
　　1、形態(tài)學觀察
　?、湃庋鄞篌w觀察。隨PMI延長,各時間點皮膚組織顏色變化不明顯,質地逐漸癱軟、液化;48h出現臭味,以

11、后逐漸明顯;96h開始可見皮表以毛孔為中心逐漸凹陷,隨時間延長凹陷逐漸擴大,數目增多;216h組織自溶液化,部分組織全層溶解呈孔狀。
　　⑵組織形態(tài)學及其顯微圖像量化分析。隨PMI延長,各時間點皮膚膠原纖維逐漸模糊、破碎、組織間隙擴大;非膠原纖維總面積呈逐漸增大趨勢,各時間點方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~144h,168h~192h,216h,264h等時間段與時間點相互之間差異顯著,P<0.05,推斷PMI窗

12、口期48h~264h,回歸方程:YNCFSA=232269XPMI+406884,R2=0.920。膠原纖維總面積,彈性纖維總面積和平均膠原纖維直徑個時間點無明顯差異,P>0.05,與PMI無相關性。
　　2、生物力學性狀
　　0h-264h,皮膚組織生物力學性狀參數呈整體階梯狀下降趨勢,與PMI相關性明顯,極限載荷各時間組方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~144h,168h~192h,216h~264h等時

13、間段之間差異顯著,P<0.05,推斷PMI窗口期48h~216h,與PMI回歸方程:YML=-33.192XPMI+375.075R2=0.779;平均力方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~192h,216h~264h等時間段之間差異顯著P<0.05,推斷PMI窗口期48h~216h,與PMI的回歸方程:YAL=-13.628XPMI+167.121R2=0.653,極限載荷變形,斷裂力等各時間組相互比較P>0.05,PM

14、I無相關性。
　　3、組織固定-萃取液檢測
　?、牌つw組織固定-萃取液色度值5例家豬皮膚組織固定-萃取液色度值隨PMI延長呈階梯狀上升趨勢,各時間組方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~120h,144h~264h等時間段之間差異顯著,P<0.05,推斷PMI窗口期48h~144h,直線回歸方程為:YChr=3.004XPMI-1.560R2=0.710。
　?、栖崛旧?例家豬皮膚組織固定-萃取液茚三酮

15、染色后Abs570(±10)nm值隨PMI延長呈階梯狀上升趨勢,各時間組差分析S-N-K法多重比較0h~24h,48h~120h,144h~216,240～264h等時間段差異顯著,推斷PMI窗口期24h~240h,直線回歸方程為:YAbs570(±10)nm=0.075XPMI-0.068R2=0.776。
　?、莗H值5例家豬皮膚組織固定-萃取液各時間組pH值無明顯差異,P>0.05。
　　結論：
　　1、水中家豬

16、皮膚組織極限載荷PMI延長呈時序性下降趨勢,與PMI之間呈明顯的相關性,推斷PMI窗口期為48～216h,精確度達±24h,可作為一種推斷晚期水尸PMI的技術手段。
　　2、水中家豬皮膚組織固定-萃取液色度值和茚三酮反應后Abs570(±10)nm值隨PMI延長呈上升趨勢,其中色度值推斷PMI窗口期為48～144h,Abs570(±10)nm值為24～240h,精確度達±12h。
　　3、水中家豬皮膚組織非膠原纖維總面積隨P