小麥耐鹽相關(guān)基因的克隆與功能分析.pdf

1、鹽害是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素,培育耐鹽轉(zhuǎn)基因作物是一個快速有效的解決方法,但缺乏有效的目的基因是限制植物耐鹽基因工程進一步發(fā)展的瓶頸。本論文的主要目的就在于尋找新的小麥耐鹽相關(guān)基因,研究它們的功能,為深入了解植物耐鹽分子機制及培育耐鹽高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小麥提供有價值的參考。本論文先后通過蛋白質(zhì)組學(xué)和基因芯片技術(shù)對鹽脅迫下小麥耐鹽突變體(RH8706-49)和敏鹽突變體(H8706-34)進行了比較分析,尋找并克隆了2個小麥耐鹽相關(guān)基因,并將

2、其轉(zhuǎn)化到擬南芥和水稻中進行耐鹽性分析,主要實驗結(jié)果如下:
　　 1.小麥鹽脅迫下的根微粒體蛋白質(zhì)組比較
　　 通過蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)分離小麥耐鹽突變體和敏鹽突變體的根微粒體蛋白質(zhì)組,共得到大約470個蛋白質(zhì)點。比較這兩個株系在鹽脅迫前后的蛋白質(zhì)表達變化,發(fā)現(xiàn)部分蛋白上調(diào)表達,部分蛋白下調(diào)表達,表明小麥耐鹽突變體與敏鹽突變體在耐鹽性方面存在差異是植物體內(nèi)大量蛋白表達協(xié)同變化的結(jié)果。
　　 應(yīng)用MALDI-TOF-M

3、S技術(shù)對15、18、23和24號蛋白點進行質(zhì)譜分析。這四個蛋白點在鹽脅迫后表達顯著增強,且在耐鹽突變體中的表達量均明顯高于在敏鹽突變體中的表達量。15號蛋白點質(zhì)譜鑒定為小麥親環(huán)素,18號蛋白點質(zhì)譜鑒定為V-H+-ATPase E亞基蛋白,23號和24號蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果為陰性,這可能與小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫極不完善有關(guān),也可能這兩個蛋白是新的未知蛋白,這需經(jīng)氨基酸測序加以確定。
　　 2.小麥V-H+-ATPase E亞基基因的克隆和

4、功能分析
　　 根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果,利用電子克隆技術(shù)并結(jié)合RT-PCR方法成功克隆出小麥V-H+-ATPase E亞基全長cDNA序列。該基因全長為742bp,含有684bp的完整開放閱讀框,編碼227個氨基酸。經(jīng)NCBI-Blast比對,該基因與大麥V-H+-ATPase E亞基基因同源性為96％,蛋白同源性高達98％,故命名為小麥V-H+-ATPase E亞基基因(Triticumasetivum vacular proton

5、 ATPase subunit E)。該基因已登陸Genebank,登陸號為DQ272489。
　　 為了檢測非生物脅迫下小麥V-H+-ATPase E亞基基因的表達模式,采用實時熒光定量PCR的方法,對該基因在鹽、ABA、PEG和冷脅迫下的相對表達量進行分析,發(fā)現(xiàn)E亞基基因在小麥耐鹽突變體中受鹽和ABA誘導(dǎo)表達增強,受PEG和冷抑制表達降低,并且在葉與根中的表達存在組織特異性。比較E亞基在耐鹽與敏鹽突變體中的表達變化,發(fā)現(xiàn)鹽及

6、ABA脅迫后,E亞基基因在耐鹽突變體中的表達均高于在敏鹽突變體中的表達。以上結(jié)果從分子水平上驗證了E亞基基因與小麥耐鹽能力的正相關(guān)關(guān)系。
　　 構(gòu)建植物雙元表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,對獲得的純合體轉(zhuǎn)基因擬南芥進行耐鹽性分析。結(jié)果顯示,過表達E亞基基因的擬南芥在鹽脅迫下,其萌發(fā)率和根長及。V-H+-ATPase活性均高于對照,細胞內(nèi)Na+含量低于對照,整體植株存活狀態(tài)好于對照,表明過表達小麥E亞基基因可增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽能力。

7、r>　　 以上實驗結(jié)果已投稿于(Plant Molecular Biology》(SCI影響因子3.65),經(jīng)編輯審稿,已修回。
　　 3.小麥鹽脅迫響應(yīng)基因TaSR的克隆和原核表達
　　 通過基因芯片技術(shù),對鹽脅迫下小麥耐鹽突變體RH8706-49中的總體基因表達進行研究,獲得了61215個小麥基因的差異表達圖譜(已發(fā)表于《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第10期)。選取鹽脅迫后表達升高的Cluster47-3號探針序列,通

8、過電子克隆技術(shù)和RT-PCR方法成功克隆到該探針的全長cDNA序列。該基因全長937bp,含有870bp的完整開放閱讀框,編碼289個氨基酸。經(jīng)NCBI-Blast比對,該基因是一個全新的未知蛋白基因,與水稻(Os03g0110900)和擬南芥(AT2G32500)的基因同源性分別為80％和66％,蛋白同源性分別為74％和49％,將其命名為TaSR(Triticum aestivum Salt Response gene)。該基因已登陸

9、Genebank,登陸號為EF580107。
　　 采用實時熒光定量PCR的方法檢測小麥TaSR基因在鹽脅迫下的表達,發(fā)現(xiàn)TaSR基因在小麥耐鹽突變體中受鹽誘導(dǎo)表達增強,而在敏鹽突變體中表達有所下降。生物信息學(xué)預(yù)測TaSR具有Dabb保守結(jié)構(gòu)域,這是一個脅迫響應(yīng)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)預(yù)測TaSR蛋白具有蛋白激酶C磷酸化位點、N-肉豆蔻?；稽c、N-糖基化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點和一個鈣調(diào)素結(jié)合位點,預(yù)示著該蛋白存

10、在受蛋白激酶和Ca2+信號調(diào)控的可能。
　　 構(gòu)建TaSR基因的原核表達載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進行蛋白質(zhì)的表達。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳顯示,在轉(zhuǎn)化菌中誘導(dǎo)出分子量約33kD的特異條帶,分子量大小與TaSR蛋白一致。分析不同誘導(dǎo)時間的蛋白表達變化,發(fā)現(xiàn)在IPTG誘導(dǎo)3h時蛋白表達量最大。結(jié)果表明TaSR基因在原核細胞中成功表達為蛋白,這為今后純化TaSR蛋白進行下一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.小麥鹽脅迫

11、響應(yīng)基因TaSR的亞細胞定位和功能分析
　　 構(gòu)建TaSR-GFP融合蛋白表達載體,通過激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥根部GFP熒光的分布,以此來確定TaSR基因的亞細胞定位。觀察結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因擬南芥中熒光主要位于細胞膜部位,而細胞核及其他部位沒有綠色熒光。由此推測,小麥TaSR基因定位于細胞膜上,它很有可能編碼一個膜蛋白。
　　 構(gòu)建植物雙元表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,對獲得的純合體轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行了耐鹽性分析。結(jié)果

12、顯示,過表達小麥TaSR基因的擬南芥在鹽脅迫下,其根長長于對照,整體植株存活狀態(tài)也好于對照,這表明TaSR基因參與擬南芥對鹽的脅迫響應(yīng),在其中起著正調(diào)控的作用。
　　 通過PCR和RT-PCR的方法篩選并鑒定出擬南芥突變體,該突變體缺失AT2G32500.1(TaSR同源基因)的表達。對突變體進行耐鹽性分析,發(fā)現(xiàn)突變體在鹽脅迫下的萌發(fā)率和根長均低于對照,表明擬南芥突變體對鹽敏感,這從反面進一步說明了TaSR基因與植物耐鹽性相關(guān)。

13、
　　 通過原子吸收的方法測定轉(zhuǎn)基因擬南芥和突變體在鹽脅迫下的離子含量變化,得到一致結(jié)果,即TaSR基因在降低細胞Na+水平、維持高K+/Na+比和細胞K+、Ca2+水平的穩(wěn)定方面起著重要作用。
　　 為了確定TaSR基因在非生物脅迫信號通路中的作用,通過定量PCR對擬南芥各脅迫信號通路上已知的一些基因進行了分析。結(jié)果顯示,在過表達小麥TaSR基因的擬南芥中,COR15a和FRY1基因表達增加,KIN2基因表達沒有明顯變

14、化,而突變體中這些基因的表達均有明顯降低；RD29B、P5CS、ADH、SAD1、SOS2和SOS3的表達變化不明顯,這表明TaSR基因可能處在COR15a、FRY1和KIN2基因的上游,通過磷脂酶和CDPK途徑參與滲透脅迫的調(diào)節(jié)。
　　 5.小麥鹽脅迫響應(yīng)基因TaSR在水稻中的功能分析
　　 小麥和水稻同屬禾谷類作物,親緣關(guān)系較近,為了更真實的反映TaSR基因的功能,我們以水稻作為轉(zhuǎn)化體系研究了TaSR基因?qū)}脅迫的響

15、應(yīng)。構(gòu)建水稻雙元表達載體,將TaSR基因轉(zhuǎn)入水稻進行過表達分析。結(jié)果顯示,鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻在種子萌發(fā)、苗高、根長、植株存活率及葉片葉綠素含量方面均高于對照,表明過表達TaSR基因可提高水稻在植株早期生長及光合功能方面對鹽脅迫的耐受能力。
　　 采用RT-PCR的方法克隆了水稻OsSR基因(Os03g0110900,TaSR同源基因)的部分序列,構(gòu)建RNAi載體并轉(zhuǎn)入水稻中。經(jīng)定量PCR鑒定,各轉(zhuǎn)基因株系中OsSR基因發(fā)生了沉默