大鼠腦挫傷后基質(zhì)金屬蛋白酶3表達變化的研究.pdf

1、前言: 腦挫傷是法醫(yī)學(xué)工作中常見的損傷類型，推斷腦挫傷時間對刑事案件的偵查及審判具有重要意義，然而準確推斷腦挫傷時間一直是法醫(yī)學(xué)中的難題，至今尚未圓滿解決。基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，參與組織形態(tài)發(fā)生、損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)等一系列的生理、病理過程，在腦挫傷修復(fù)過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗通過建立大鼠腦挫傷模型，研究基質(zhì)金屬蛋白酶3在腦挫傷修復(fù)過程中的表達變化規(guī)律，以期為法醫(yī)學(xué)實踐中準確推斷腦挫

2、傷時間提供一種新的方法。 材料與方法: 一、動物模型的制作分組與對照 雄性SD大鼠50只，體重在200-250g之間，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。隨機分為10組，每組5只，其中8組為實驗組，1組為對照組，1組為假手術(shù)組。實驗組采用吳旭等研制的大鼠腦挫傷模型制作方法，制造大鼠腦挫傷模型。大鼠稱重后，乙醚吸入預(yù)麻醉，2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮，在人字縫前3mm，矢狀縫旁3mm

3、處鉆直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完好。采用自由落體打擊裝置，以30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織。術(shù)后動物分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后6h、12h、24h、3d、5d、7d、10d、14d將大鼠麻醉后脫頸椎處死，手術(shù)取出腦組織，沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分，一份用于免疫組化染色，另一份用于Western blot檢測。假手術(shù)組僅行顱骨鉆孔。對照組及假手術(shù)組，以同樣方法取相同部位的腦組織作為對照。

4、 二、免疫組織化學(xué)染色 腦組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法(SP法)進行免疫組化染色，并用蘇木素復(fù)染細胞核，具體步驟同試劑盒說明書。MMP-3抗體1：400稀釋，4℃孵育過夜。染色過程中另以PBS替代一抗，作為陰性對照。同時進行常規(guī)H.E.染色。山羊抗大鼠MMP-3多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)

5、有限公司。 三、Western blot檢測 提取腦組織蛋白并進行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)印，5％脫脂牛奶封閉，一抗(1：1000稀釋)、二抗(1：2500稀釋)孵育后，ECL顯色。實驗中以GAPDH為內(nèi)參。 實驗結(jié)果 一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對照組及假手術(shù)組腦組織未見MMP-3陽性染色。實驗組中，傷后6h組腦組織開始出現(xiàn)陽性染色，胞漿著色，程度較弱，陽性細胞主要為神經(jīng)元，12h組

6、染色程度增強。傷后24h組表達MMP-3的神經(jīng)元顯著增多，并可見少量膠質(zhì)細胞出現(xiàn)MMP-3陽性。3d組MMP-3陽性染色進一步增強，傷后5d組陽性細胞數(shù)及染色強度都達到高峰，呈深棕黃色，彌漫分布于神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的胞漿和胞核中。傷后7d組MMP-3陽性染色開始減弱，10d組陽性細胞減少，至傷后14d仍有少量MMP-3表達。使用Motic Images Advanced 3.2軟件對各組MMP-3免疫組化染色陽性反應(yīng)物進行檢測，統(tǒng)計分析結(jié)

7、果顯示，陽性反應(yīng)物面積百分比及陽性反應(yīng)物平均光密度值差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。 二、Western blot結(jié)果 對照組及假手術(shù)組腦組織未見MMP-3表達，挫傷后6h開始出現(xiàn)MMP-3表達，隨后表達量逐漸上升，5d達到高峰，以后逐漸下降，14d時仍有表達。應(yīng)用Fluorchem V 2.0 Stand Alone軟件獲取感光條帶的平均灰度值，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 本實驗在建立大鼠腦挫傷模型的