吉非替尼對奧沙利鉑體外抗睪丸癌作用的影響及可能機制.pdf

1、目的：
　　1.觀察吉非替尼（gefitineb）對睪丸間質(zhì)腫瘤（I-10）細胞間縫隙連接（gap junction，GJ）功能的影響。
　　2.觀察吉非替尼與奧沙利鉑（oxaliplatin，OHP）合用對I-10細胞生存率及凋亡的影響并探討其可能機制。
　　3.探討吉非替尼增強I-10細胞GJ功能的激酶（PKC、src）調(diào)節(jié)機制。
　　方法：
　　1.MTT法檢測藥物對I-10細胞生長的影響。
　

2、　2.細胞熒光示蹤法（parachute）檢測I-10細胞間的GJ功能。
　　3.細胞免疫熒光法檢測I-10細胞膜上Cx43的表達。
　　4.Western blot法檢測I-10細胞中Cx43、磷酸化Cx43、激酶PKC、src、凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3、9的表達。
　　5.Annexin V-FITC/PI雙染法和Hoechst33258法分別檢測I-10細胞的早期和晚期凋亡。
　　結(jié)果：

3、
　　1.0~5μM（0.25、0.5、1、2μM）的吉非替尼顯著增強I-10細胞間的熒光傳遞能力及細胞膜上Cx43的蛋白表達。與對照組相比，吉非替尼藥物組的GJ熒光傳遞分別增強40.17％±18.4%（P<0.05）、190.43%±11.5%（P<0.01）、167.81%±9.8%（P<0.01）、153.38%±10.4%（P<0.01），其中濃度在0.5μM作用時的作用最強。
　　2.實驗中選用0.5μM的吉非替尼

4、與不同濃度的OHP合用，觀察其對I-10細胞的毒性作用。與單用OHP比較，40μM的OHP與吉非替尼合用時細胞毒性作用顯著增強（P<0.01）；40μM OHP與吉非替尼合用對I-10細胞的早期和晚期凋亡進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與OHP單用組相比，合用組的早期和晚期凋亡率分別增加了32.6%±14.2%和30.5%±9.7%（均P<0.05）。
　　3.細胞熒光示蹤法檢測細胞GJ功能結(jié)果表明，與OHP單用組相比，合用組（吉非替尼+OHP

5、）的GJ熒光傳遞能力增強180%±30.6%（P<0.01），膜Cx43表達亦顯著增強；Western blot檢測 Cx43總蛋白和磷酸化蛋白結(jié)果表明，與OHP單用組相比，合用組（吉非替尼+OHP）的Cx43總蛋白表達增加了170.43%±23.3%，磷酸化水平降低了57.94%±10.3%（均P<0.01）。
　　4.Western blot檢測檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果表明，與OHP單用組相比，合用組（吉非替尼+OHP）凋亡蛋

6、白Bax/Bcl-2的比值增加了63.05%±15.4%、剪切的caspase3、9表達分別增加了43.2%±5.2%和32.5%±6.2%，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。
　　5.吉非替尼作用I-10細胞后，src、PKC激酶的表達降低，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。選用src激酶抑制劑PP2和PKC激酶抑制劑GF109203X作用I-10細胞后可顯著增強GJ功能，并且細胞膜蛋白表達增加，Cx43磷酸化水平降低

7、，與對照組相比差異均有顯著性（P<0.01）。結(jié)果提示吉非替尼增加I-10的GJ功能可能與其抑制src和PKC的表達有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.吉非替尼增強I-10細胞的GJ功能，該作用與磷酸化Cx43蛋白表達降低有關(guān)。
　　2.磷酸化Cx43水平降低與src和PKC激酶水平降低有關(guān)。
　　3.吉非替尼與OHP合用可顯著增強OHP的細胞毒性和凋亡誘導(dǎo)作用，該作用與吉非替尼增強細胞的GJ功能，Bax/Bcl-2比率