第一部分化合物WYD1-8和WYD7-6改善α-synuclein轉(zhuǎn)錄基因小鼠運(yùn)動(dòng)障礙的研究第二部分熱休克蛋白70抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥作用的研究.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分:化合物WYD1-8和WYD7-6改善α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)障礙的研究
　　帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)是以運(yùn)動(dòng)障礙伴隨震顫、僵直等臨床癥狀為主的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失和以α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)為主要成分的路易氏小體(Lewy body)的形成。近年來(lái)研究表明，腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞激活引

2、起的神經(jīng)炎癥可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，在PD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。WYD1-8和WYD7-6是由我所植化室合成的間苯三酚類衍生物，前期實(shí)驗(yàn)表明這兩種化合物在體外均具有明顯抑制神經(jīng)炎癥的活性，另外對(duì)MPTP誘發(fā)的急性PD小鼠模型和MPTP+丙磺舒誘發(fā)的慢性PD小鼠模型也具有良好的治療作用。本研究采用α-Syn(A53T)轉(zhuǎn)基因PD小鼠模型對(duì)WYD1-8和WYD7-6治療PD的藥效學(xué)進(jìn)一步評(píng)價(jià)和對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。4月齡α-Syn

3、(A53T)轉(zhuǎn)基因小鼠開(kāi)始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力障礙。每天灌胃給予小鼠WYD1-8(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)和WYD7-6(5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg)，連續(xù)12W，每2W進(jìn)行一次運(yùn)動(dòng)行為學(xué)測(cè)試。12W后對(duì)小鼠腦中各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，化合物WYD1-8和WYD7-6對(duì)α-Syn(A53T)轉(zhuǎn)基因PD小鼠運(yùn)動(dòng)能力具有明顯的改善作用。小鼠黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶(Tyrosine hyd

4、roxylase，TH)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，紋狀體多巴胺(dopamine，DA)的含量顯著升高。化合物WYD1-8和WYD7-6還可明顯減少中腦α-Syn的磷酸化和聚集。對(duì)其機(jī)制研究表明WYD1-8和WYD7-6可明顯抑制小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，顯著降低腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的含量，顯著減少環(huán)氧合酶-2(Cyclooxy

5、genase-2，COX-2)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible nitric synthase，iNOS)的表達(dá)。此外，化合物WYD1-8和WYD7-6可明顯提高Bcl-2的表達(dá)，表明這兩種化合物可能有抑制神經(jīng)元凋亡的作用。以上結(jié)果表明化合物WYD1-8和WYD7-6可明顯提高α-Syn(A53T)轉(zhuǎn)基因小鼠多巴胺能神經(jīng)元的功能從而改善小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙。WYD1-8和WYD7-6對(duì)α-Syn(A53T)轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可

6、能與其抑制腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥有關(guān)。
　　第二部分:熱休克蛋白70抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥作用的研究
　　神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元進(jìn)行性丟失而引起的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，盡管該類疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但近期的研究表明膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病中起著重要的作用。以往對(duì)神經(jīng)炎癥的研究主要集中在小膠質(zhì)細(xì)胞上，近期研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生，但作用機(jī)制仍不明確。熱休克蛋白70(heat sh

7、ock protein70，Hsp70)是細(xì)胞內(nèi)重要的分子伴侶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。近年來(lái)研究表明Hsp70還可調(diào)控炎癥反應(yīng)，在帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)病人腦中發(fā)現(xiàn)激活的膠質(zhì)細(xì)胞周圍有Hsp70的存在。研究表明過(guò)表達(dá)Hsp70可有效的抑制多種因素導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)元和改善神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，進(jìn)一步提示Hsp70可能參與到神經(jīng)炎癥的調(diào)控中。但Hsp70在α-突觸

8、核蛋白(α-synuclein，α-Syn)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用尚不明確。本研究中，我們采用α-Syn聚集體刺激原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察Hsp70在星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥中的作用并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。研究發(fā)現(xiàn)，α-Syn刺激原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h后，可明顯提高膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein，GFAP)、環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）和

9、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible nitric synthase，iNOS)，腫瘤壞死因子-α（Tumornecrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的釋放量明顯增高。伴隨著炎癥的發(fā)生，Hsp70的表達(dá)也隨之升高。當(dāng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)Hsp70后，與α-Syn單獨(dú)刺激相比炎癥反應(yīng)明顯降低，表現(xiàn)為GFAP、COX-2、iNOS表達(dá)顯著降低、培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β

10、的含量也明顯降低。進(jìn)一步采用Hsp70抑制劑VER155008抑制Hsp70的活性后，我們發(fā)現(xiàn)與α-Syn單獨(dú)刺激相比炎癥反應(yīng)明顯升高，表現(xiàn)為GFAP、COX-2和iNOS的表達(dá)明顯升高，TNF-α和IL-1β的含量明顯升高。對(duì)其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)α-Syn刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞引起JNK和IκB的磷酸化、NF-κBp65亞基的轉(zhuǎn)位入核均明顯提高，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能與激活JNK/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。過(guò)表達(dá)Hsp70后，JNK