賁門(mén)癌和食管BRAF基因突變及蛋白表達(dá)的分析.pdf

1、目的:賁門(mén)癌是我國(guó)特別是北方地區(qū)一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，國(guó)際衛(wèi)生組織(World Health Organization，簡(jiǎn)稱WHO)將騎跨于食管和胃交界處的腺癌性病變定義為賁門(mén)癌，其具有特異的臨床表現(xiàn)與組織學(xué)、解剖學(xué)、生物學(xué)特征。因其病理類型多為腺癌，放療治療效果不理想。食管癌也是人類常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年新增患者超過(guò)30萬(wàn)人，其發(fā)病率和死亡率各國(guó)差異很大，其中發(fā)展中國(guó)家比例較高。食管癌的病理類型主要分為鱗狀細(xì)胞癌、腺

2、癌、癌肉瘤、肉瘤樣癌以及小細(xì)胞癌。我國(guó)是世界食管癌高發(fā)地之一，其死亡率占全球的50％以上，粗死亡率為17.38/10萬(wàn)，占總癌亡人數(shù)的16.41％。鱗狀細(xì)胞癌為我國(guó)食管癌主要病理學(xué)類型，約占發(fā)病率的90％左右。目前，賁門(mén)癌和食管癌患者的主要治療手段是手術(shù)治療，但患者術(shù)后的生存期并不樂(lè)觀，其5年生存率都僅為30％左右。賁門(mén)癌和食管癌有一些值得注意的病理學(xué)和流行病學(xué)相似點(diǎn)，如發(fā)病年齡、性別等。在食管癌高發(fā)區(qū)，賁門(mén)癌的發(fā)病率也較高，食管癌高發(fā)

3、區(qū)賁門(mén)癌發(fā)病率約為50/10萬(wàn)，是食管癌的2/3，特別是河北省磁縣和涉縣等地區(qū)這一流行病學(xué)特征更為突出。因二者有相似的病理學(xué)、流行病學(xué)等特點(diǎn)，故進(jìn)一步比較研究同一地區(qū)賁門(mén)癌與食管癌發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制，對(duì)于尋找新的治療靶點(diǎn)以提高個(gè)體化治療效果，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　BRAF基因，別名鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體(v-rafmurinesarc-omaviraloncogenehomolog B1)，位于染色體7q34由7

4、83個(gè)氨基酸組成，能夠編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAF家族成員之一，而且還是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號(hào)通路中相當(dāng)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，調(diào)控多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種人類惡性腫瘤如惡性黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌中均存在不同比例的BRAF基因突變。當(dāng)前，在我國(guó)關(guān)于BRAF基因在賁門(mén)癌及食管鱗狀細(xì)胞癌組織是否發(fā)生突變的研究鮮有報(bào)道。
　　本研究采用基因測(cè)序的方法檢

5、測(cè)了在人賁門(mén)癌、食管鱗狀細(xì)胞癌組織及其相對(duì)遠(yuǎn)癌組織（距癌組織邊緣5cm以上）中BRAF基因第11外顯子及第15外顯子的突變情況，并運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)了賁門(mén)癌、食管鱗狀細(xì)胞癌組織及相對(duì)遠(yuǎn)癌組織中BRAF蛋白的表達(dá)情況，分析了其與賁門(mén)癌及食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病例特征各指標(biāo)間的關(guān)系，探討了BRAF基因突變?cè)谫S門(mén)癌及食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床意義，為今后制備BRAF基因抑制劑、尋找應(yīng)用于賁門(mén)癌及食管鱗狀細(xì)胞癌分子靶向治療的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)

6、。
　　方法:收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科在2014年2月-2014年12月期間經(jīng)手術(shù)治療的賁門(mén)癌、食管鱗狀細(xì)胞癌患者新鮮組織標(biāo)本共91例。其中賁門(mén)癌標(biāo)本46例，食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本45例。在賁門(mén)癌標(biāo)本中，男性患者38例，女性患者8例，男女比例為4/1，病人平均年齡為59.8歲，高分化4例，中分化22例，低分化20例。在食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中，男性患者27例，女性患者18例，男女比例為3/2，病人平均年齡為61.3歲，高分化3例，中

7、分化31例，低分化11例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療及化療，全部手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。對(duì)照組選取這91例患者的新鮮遠(yuǎn)癌組織標(biāo)本（距癌組織邊緣5cm以上）。分別記錄患者性別、年齡、病理類型、分化程度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病例情況。采用組織全基因組提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和基因測(cè)序方法，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本中BRAF基因的突變情況，并運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)了兩種癌組織及相應(yīng)遠(yuǎn)癌組織中BRAF蛋白的表達(dá)情況，分析其與賁

8、門(mén)癌及食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病例特征的關(guān)系。采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組計(jì)數(shù)資料的比較采用四格表資料的卡方檢驗(yàn)，兩組等級(jí)資料的比較采用Mann-whitney U秩和檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、賁門(mén)癌、食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BRAF基因突變檢驗(yàn)結(jié)果及臨床特點(diǎn)
　　在46例賁門(mén)癌組織中檢測(cè)到3例存在于BRAF基因第15外顯子突變，其第11外顯子均未見(jiàn)突變。突變類型均

9、為V600E，即基因突變發(fā)生在第15外顯子的第1799個(gè)核苷酸，導(dǎo)致其編碼的纈氨酸被谷氨酸取代。在遠(yuǎn)癌組織中未檢測(cè)到上述突變。免疫組化結(jié)果顯示3例BRAF基因突變的賁門(mén)癌組織陽(yáng)性表達(dá)BRAF蛋白;3例患者均伴有周?chē)馨徒Y(jié)的轉(zhuǎn)移，均可見(jiàn)脈管瘤栓，TNM分期分別ⅢB、ⅢB、ⅢC期，分化程度分別為Ⅱ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)，患者性別均為男性，年齡分別是59歲，68歲與55歲。
　　在45例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中未檢測(cè)到BRAF基因第11外顯子和第1

10、5外顯子存在突變。測(cè)序結(jié)果顯示，有4個(gè)樣品在第11外顯子上增加了一個(gè)堿基C或T，即會(huì)造成密碼子移碼突變，結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示該標(biāo)本BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)，考慮該結(jié)果可能為測(cè)序誤差所致。
　　2、賁門(mén)癌、食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BRAF蛋白表達(dá)及臨床病例特征之間的關(guān)系
　　免疫組化結(jié)果顯示在46例賁門(mén)癌組織標(biāo)本中，22例賁門(mén)癌細(xì)胞中可見(jiàn)分布于腫瘤細(xì)胞胞漿中的棕色顆粒，BRAF蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為47.82％;在相應(yīng)遠(yuǎn)癌組織中

11、僅3例出現(xiàn)棕色顆粒，表達(dá)陽(yáng)性率為6.52％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩者具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　在45例食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中，28例食管鱗狀細(xì)胞癌組織BRAF蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為62.22％;在相應(yīng)遠(yuǎn)癌組織中僅4例出現(xiàn)棕色顆粒，表達(dá)陽(yáng)性率為8.89％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩者具有顯著性差異(P＜0.05）。
　　本研究顯示46例賁門(mén)癌組織中BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)共22例，總的陽(yáng)性率為47.82％。男性陽(yáng)性率50.

12、0％，女性陽(yáng)性率37.5％;年齡60歲以上（包括60歲）患者陽(yáng)性率60.0％，60歲以下患者陽(yáng)性率38.5％;低分化者陽(yáng)性率40.0％，中分化者陽(yáng)性率59.1％，高分化者陽(yáng)性率25.0％;Ⅰ期患者陽(yáng)性率18.2％，Ⅱ期患者陽(yáng)性率33.3％，Ⅲ期患者陽(yáng)性率75.0％;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率62.5％，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率14.3％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，BRAF蛋白的表達(dá)陽(yáng)性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(x2=9.073，P＜0.05)及TNM分期(Z=

13、-3.242，P＜0.05)有關(guān)，與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。
　　45例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)共28例，總陽(yáng)性率為62.22％。分布為:男性陽(yáng)性率55.6％，女性陽(yáng)性率72.2％;年齡60歲以上（包括60歲）患者陽(yáng)性率53.6％，60歲以下患者陽(yáng)性率76.5％;低分化者陽(yáng)性率72.7％，中分化者陽(yáng)性率54.8％，高分化者陽(yáng)性率100.0％;Ⅰ期患者陽(yáng)性率21.4％，Ⅱ期患者陽(yáng)性率50.0％，Ⅲ期患者陽(yáng)性

14、率88.2％;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率82.6％，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率40.9％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，BRAF蛋白的表達(dá)陽(yáng)性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(x2=8.318，P＜0.05)及TNM分期(Z=-3.718，P＜0.05)有關(guān)，與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BRAF基因突變?cè)谫S門(mén)癌的發(fā)展中具有一定作用，可能是賁門(mén)癌生存不良的新預(yù)測(cè)因素，可望作為賁門(mén)癌的分子靶向治療新的目的基因。而B(niǎo)RAF基