穩(wěn)定過表達(dá)Wnt5a對K562細(xì)胞生物學(xué)性狀影響的研究.pdf

1、目的：
　　 Wnt5a蛋白是一種分泌型的糖蛋白,屬于Wnt家族。Wnt5a在不同類型的腫瘤中發(fā)揮著不同的作用,它能促進(jìn)乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤生長甚至可促使腫瘤的侵襲。而在甲狀腺癌、結(jié)腸直腸癌等腫瘤中Wnt5a可能發(fā)揮著抑制腫瘤的作用。Wnt5a在血液腫瘤中所起的作用,至今不明確。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄病毒建立穩(wěn)定過表達(dá)Wnt5a的K562細(xì)胞株--K562-Wnt5a細(xì)胞,觀察該細(xì)胞株增殖和分化的改變,并檢測穩(wěn)定過表達(dá)Wnt

2、5a對一些血液腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　 方法
　　 1.以質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a為模板,使用含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收PCR產(chǎn)物,對pSEB-flag和PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切、純化、連接,并轉(zhuǎn)化和篩選抗性細(xì)菌克隆,提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切、測序鑒定,獲得pSEB-Wnt5a。
　　 2.將質(zhì)粒pCL-Ampho、pSEB-Wnt5a(或pSEB-flag)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并收集含有逆

3、轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。
　　 3.使用以上所得上清液感染K562細(xì)胞,并使用滅瘟素篩選抗性細(xì)胞克隆。
　　 4.RT-PCR檢測K562細(xì)胞Wnt5a mRNA的表達(dá),Western blotting檢測K562細(xì)胞Wnt5a蛋白表達(dá)。病毒空載體感染K562細(xì)胞,獲得K562-vector細(xì)胞;Wnt5a逆轉(zhuǎn)錄病毒感染K562細(xì)胞獲得K562-Wnt5a細(xì)胞。
　　 5.臺盼藍(lán)活細(xì)胞染色計數(shù)法,檢測細(xì)胞增殖;MTT試

4、驗檢測細(xì)胞活性的變化。
　　 6.流式細(xì)胞技術(shù)檢測過表達(dá)Wnt5a對K562細(xì)胞周期分布的影響。
　　 7.光鏡(瑞氏染色)和透射電鏡分別觀察K562-Wnt5a細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 8.RT-PCR法檢測K562-Wnt5a細(xì)胞中白血病相關(guān)基因bcr/ab1、P53、Rb、WT-1和n-Ras的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果
　　 1.擴(kuò)增獲得Wnt5a序列,經(jīng)過酶切、連接得到重組質(zhì)粒pSEB

5、-Wnt5a,經(jīng)過酶切和測序鑒定與預(yù)期目的一致。
　　 2.使用重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a包裝得到病毒,并感染K562細(xì)胞,經(jīng)過篩選得到感染成功的細(xì)胞克隆,并且Wnt5a mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高。
　　 3.與K562-vector相比,K562-Wnt5a細(xì)胞增殖受到抑制。
　　 4.過表達(dá)Wnt5a使G2期K562細(xì)胞所占比例下降,而S期和G1期有增長的趨勢。
　　 5.與K562-vect

6、or細(xì)胞相比,K562-Wnt5a細(xì)胞表現(xiàn)出分化的特征,如:大小不一,邊緣偽足減少,核漿比變小,胞漿染色變淺,出現(xiàn)非特異性顆粒,細(xì)胞核聚集向細(xì)胞的一側(cè)。電鏡下,K562-Wnt5a細(xì)胞,形態(tài)變化顯著,細(xì)胞核偏向一側(cè),常染色質(zhì)較多,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器發(fā)達(dá)。
　　 6.與對照細(xì)胞K562-vector細(xì)胞相比,K562-Wnt5a細(xì)胞中bcr/ab1、P53、Rb、WT-1和n-Ras基因mRNA表達(dá)水平均增高。
　　 結(jié)論

7、r>　　 1.應(yīng)用PCR的方法從質(zhì)粒AdTrack-Wnt5a中得到Wnt5a基因序列片斷,并重組得到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSEB-Wnt5a。
　　 2.轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝得到含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清,并經(jīng)過感染和篩選得到穩(wěn)定過表達(dá)Wnt5a的細(xì)胞株K562-Wnt5a細(xì)胞。
　　 3.穩(wěn)定過表達(dá)Wnt5a改變了K562細(xì)胞的周期的分布,抑制了K562細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)K562細(xì)胞向成熟階段分化,這可能與它上調(diào)了一些白