地西他濱對(duì)MDS-AML患者及細(xì)胞株P(guān)D-1-PD-L1表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：隨著FDA批準(zhǔn)抗CTLA-4和PD-1抗體在惡性晚期實(shí)體瘤中的應(yīng)用。免疫治療成為繼手術(shù)、化療、放療后一種有效且副作用較小的療法而被廣泛應(yīng)用于臨床。通過(guò)調(diào)動(dòng)人體自身免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤而非針對(duì)腫瘤本身,給新藥研發(fā)的思維帶來(lái)革命性的變化?？筆D-1單抗與現(xiàn)有治療藥物的聯(lián)合，是目前具有潛力的研發(fā)方向。幾乎所有的腫瘤藥物，對(duì)免疫系統(tǒng)多或少有作用，這對(duì)他們的療效和安全性產(chǎn)生重要影響。地西他濱(decitabine DAC）對(duì)免疫系統(tǒng)有無(wú)影響，研

2、究較少。骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic sydrome MDS）和急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia AML）都是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。DNA甲基化(DNA methylation)導(dǎo)致的抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)理。DNA高甲基化在惡性血液病中廣泛存在，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)甲基化修飾可以用藥物逆轉(zhuǎn)，使提高耐藥及緩解復(fù)發(fā)率成為可能。DAC作為甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，現(xiàn)已被FAB推薦用于MDS、

3、老年AML、CMML的治療中，但仍存在耐藥、復(fù)發(fā)現(xiàn)象。
　　近期，PD-1/PD-L1信號(hào)系統(tǒng)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用屢見報(bào)道， PD-1抗體應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤也取得了令人鼓舞的效果。因此研究DAC對(duì)PD-1/PD-L1的影響，聯(lián)合兩者共同應(yīng)用，有望成為血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的新方案。
　　本實(shí)驗(yàn)研究DAC治療MDS及AML患者前后PD-1/PD-L1的變化及其在SKM-1、HL-60細(xì)胞株中PD-L1的變化，為探索新的治療

4、方法打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1本研究收集了2016年1月至2017年1月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科根據(jù)WHO2008分型初治MDS中符合WPSS預(yù)后分層中危組及高危組并接受DAC治療的病人18例和初治AML并接受DAC治療的病人20例（其中MDS中危組5例，高危組13例）以及非惡性血液病患者5例設(shè)為對(duì)照。MDS患者接受了DAC20mg/m25天的方案；AML患者接受了DAC20mg/m23天+CAG（Acla20mg

5、d4-6、Ara-c10-20mg/m2 d4-10、G-CSF300ug皮下注射d4-10）的化療方案。均收集DAC應(yīng)用前和DAC應(yīng)用5天、3天后外周血和骨髓細(xì)胞（AML患者收集DAC+CAG第10天的骨髓細(xì)胞）。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)以Per-CP CD45和SSA設(shè)門確定淋巴細(xì)胞及原始細(xì)胞分群，檢測(cè)DAC治療前后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1和骨髓原始細(xì)胞上PD-L1的變化、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技

6、術(shù)檢測(cè)DAC治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞PD-1mRNA、PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化；
　　2體外培養(yǎng)SKM-1、HL-60細(xì)胞株，應(yīng)用CCK-8法探索適宜的DAC濃度，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DAC處理前后PD-L1的變化、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)DAC處理后PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1 FCM檢測(cè)DAC治療前MDS中、高危組和AML患者外周血T淋巴細(xì)胞上PD-1和

7、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的變化：(Table1, Fig1)
　　MDS中、高危組及AML組患者DAC治療前外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)高于正常對(duì)照組，骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)差別。
　　2 FCM檢測(cè)DAC治療后MDS中、高危組和AML患者外周血T淋巴細(xì)胞上PD-1和骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的變化：(Table2, Fig1)
　　MDS中、高危組及A

8、ML組患者DAC治療后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)高于正常對(duì)照組及治療前。
　　3 FCM檢測(cè)MDS/AML緩解組和未緩解組患者PD-1/PD-L1表達(dá)：(Table3, Fig2)
　　MDS緩解組/未緩解組：未緩解組外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)明顯高于緩解組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、（P=0.001）。
　　AML緩解組/未緩解組：未緩解組外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)明顯高于緩解組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。
　　由此表明，PD-1/PD-L1高表達(dá)可能與DAC耐藥有關(guān)，是預(yù)后不良的指標(biāo)。
　　4 PT-PCR檢測(cè)DAC治療前MDS中、高危組和AML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上PD-1mRNA和骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1

10、mRNA相對(duì)表達(dá)量變化：(Table4, Fig3-4)
　　MDS中、高危組及AML組患者DAC治療前外周血單個(gè)細(xì)胞上PD-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組無(wú)差別。
　　5 PT-PCR檢測(cè)DAC治療后MDS中、高危組和AML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上PD-1mRNA和骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量變化：(Table5, Fig3-4)
　　M

11、DS中、高危組及AML組患者DAC治療后外周血單個(gè)細(xì)胞上PD-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組及治療前。
　　6 RT-PCR檢測(cè)MDS/AML患者緩解組和未緩解組PD-1/PD-L1表達(dá)：(Table6, Fig5)
　　MDS緩解組/未緩解組：未緩解組外周血單個(gè)核細(xì)胞上PD-1mRNA相對(duì)表達(dá)量、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于緩解組,差別有統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義（P=0.001）。
　　AML緩解組/未緩解組：未緩解組外周血單個(gè)核細(xì)胞上PD-1mRNA相對(duì)表達(dá)量、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于緩解組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。
　　由此同樣表明，PD-1/PD-L1高表達(dá)可能與DAC耐藥有關(guān)，是預(yù)后不良的指標(biāo)。
　　7 DAC對(duì)SKM-1、HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用
　　應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)DAC對(duì)SKM-1、HL-60細(xì)胞增殖的

13、影響，以0、0.5、5、50、500umol/l濃度梯度的DAC干預(yù)SKM-1、HL-60細(xì)胞24h、48h、72h后，結(jié)果顯示DAC對(duì)SKM-1、HL-60細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且具有時(shí)效及劑量依賴特點(diǎn)；SKM-1、HL-6048h IC50接近50umol/l、72h IC50接近0.5umol/l。分別以0、0.5、50、500umol/l濃度梯度的DAC進(jìn)行FCM及RT-PCR檢測(cè)。
　　8 FCM檢測(cè)不同時(shí)間和濃度D

14、AC處理SKM-1、HL-60后PD-L1的變化：(Table7, Fig6-7)
　　MDS/白血病SKM-1、HL-60細(xì)胞株P(guān)D-L1的平均表達(dá)值隨DAC濃度（0、0.5、50、500umol/l）及時(shí)間（24h、48h、72h）的變化而增加， DAC濃度50umol/l時(shí)表達(dá)最高。
　　9 RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間和濃度DAC處理SKM-1、HL-60后PD-L1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化：(Table8-9, Fi

15、g8-9)
　　MDS/白血病SKM-1、HL-60細(xì)胞株P(guān)D-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量隨DAC濃度（0、0.5、50、500umol/l）及時(shí)間（24h、48h）的變化而增加，DAC濃度50umol/l時(shí)，PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量最高。
　　結(jié)論：
　　1正常人外周血T淋巴細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞上存在PD-1/PD-L1的表達(dá)。
　　2 MDS中危組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)差別，外周血

16、T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)高于正常對(duì)照組；經(jīng)DAC治療后PD-1/PD-L1表達(dá)明顯升高。
　　3 MDS高危組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)差別，外周血T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)高于正常對(duì)照組；經(jīng)DAC治療后PD-1/PD-L1表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組及MDS中危組。
　　4 AML患者接受DAC治療前骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)差別，外周血T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)高于正常對(duì)照組，接受

17、DAC治療后PD-1/PD-L1的表達(dá)都明顯升高。
　　5 PD-1/PD-L1與預(yù)后：MDS、AML未緩解組FCM外周血T淋巴細(xì)胞上 PD-1表達(dá)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上 PD-L1表達(dá)和 RT-PCR外周血PD-1mRNA相對(duì)表達(dá)量、骨髓單個(gè)核細(xì)胞上PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量都明顯高于緩解組，PD-1/PD-L1表達(dá)增高可能介導(dǎo)DAC耐藥，可作為評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　6 MDS/白血病細(xì)胞株SKM-1、HL-60細(xì)胞株上