控釋細(xì)胞因子的膠原凝膠生物支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)的影響.pdf

1、中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)元無(wú)法再生，損傷平面以下運(yùn)動(dòng)，感覺(jué)及括約肌功能喪失?，F(xiàn)有的治療措施只能延緩脊髓損傷，無(wú)法逆轉(zhuǎn)已損傷的神經(jīng)組織。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為其治療提供了一個(gè)全新的方向。神經(jīng)干細(xì)胞具有增殖、自我更新和分化成神經(jīng)細(xì)胞的能力，從而替代死亡的神經(jīng)元，重建神經(jīng)通路。但目前單純神經(jīng)干細(xì)胞移植由于缺乏細(xì)胞外基質(zhì)的支持，其存活率和分化特性嚴(yán)重受到影響。而神經(jīng)組織工程技術(shù)治療脊髓損傷是現(xiàn)在研究的一個(gè)熱點(diǎn)，本課題組擬通過(guò)神經(jīng)球方法原代培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)

2、干細(xì)胞，并研究神經(jīng)干細(xì)胞體外分化特性，利用培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞和膠原凝膠生物支架一起構(gòu)建神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)模型，并檢測(cè)膠原凝膠生物支架與神經(jīng)干細(xì)胞的生物相容性，最后構(gòu)建控釋細(xì)胞因子的膠原凝膠生物支架，并觀察其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)影響。本研究共分為三個(gè)部分：
　　在第一部分中，我們利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的方法分離培養(yǎng)大鼠胚胎皮質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞，用免疫熒光的方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞的標(biāo)志物。結(jié)果顯示體外無(wú)血清培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神

3、經(jīng)干細(xì)胞，可得到懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球，但懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球可以發(fā)生融合，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示神經(jīng)球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白，經(jīng)過(guò)胎牛血清誘導(dǎo)后，神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，其中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例最高。
　　在第二部分中我們將神經(jīng)干細(xì)胞與膠原凝膠進(jìn)行三維培養(yǎng)構(gòu)建神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞與膠原凝膠具有良好的生物相容性，膠原凝膠三維支架中的神經(jīng)干細(xì)胞可以快速增殖并形成神經(jīng)克隆球，這些神經(jīng)克隆球可

4、以被傳代并且重新在懸浮培養(yǎng)體系中形成傳統(tǒng)的神經(jīng)球。膠原凝膠中的神經(jīng)克隆球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物巢蛋白，并且可以分化形成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。與懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球相比，早期三維培養(yǎng)中形成的神經(jīng)克隆球其分化為神經(jīng)元的潛能更高，且三維培養(yǎng)中神經(jīng)球突起長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于貼壁分化組中神經(jīng)球的長(zhǎng)度。
　　在第三部分中我們首先構(gòu)建控釋細(xì)胞因子的膠原凝膠支架，利用ELISA方法檢測(cè)生物支架中細(xì)胞因子的釋放曲線，結(jié)果顯示膠原凝膠是良好的

5、細(xì)胞因子控釋載體支架，細(xì)胞因子在體外釋放可達(dá)10天，控釋細(xì)胞因子的膠原凝膠支架與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，并分為共分為四組：A：復(fù)合BDNF-NT-3膠原凝膠組（實(shí)驗(yàn)組）；B：復(fù)合 BDNF膠原凝膠組（對(duì)照組）；C:復(fù)合 NT-3膠原凝膠組（實(shí)驗(yàn)組）D：膠原凝膠組（對(duì)照組）。利用 CCK-8檢測(cè)各培養(yǎng)組中的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示復(fù)合BDNF-NT-3膠原凝膠組中細(xì)胞活力要高于其他實(shí)驗(yàn)組，其中膠原凝膠組的細(xì)胞活力最低。隨機(jī)選取各組20個(gè)神經(jīng)球，同時(shí)

6、利用DP71圖像處理軟件計(jì)算各組神經(jīng)軸突的長(zhǎng)度，結(jié)果顯示復(fù)合BDNF-NT-3膠原凝膠組中神經(jīng)突起的長(zhǎng)度要長(zhǎng)于其他各組。各組神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)一周后，用1%的FBS誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示各組神經(jīng)干細(xì)胞均可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，復(fù)合BDNF-NT-3膠原凝膠組分化的神經(jīng)元比例最高，其中在復(fù)合 BDNF-NT-3膠原凝膠組和復(fù)合BDNF膠原凝膠組中神經(jīng)干細(xì)胞分化比例的順序?yàn)樯窠?jīng)元>神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞>少突膠質(zhì)細(xì)胞，在復(fù)合NT-3膠原凝

7、膠組和膠原凝膠組中神經(jīng)干細(xì)胞分化比例的順序?yàn)樯窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞>神經(jīng)元>少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　綜上所述，在無(wú)血清含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)條件下，利用神經(jīng)球方法可以分離培養(yǎng)出胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞具有增殖和多向分化的能力。膠原凝膠與神經(jīng)干細(xì)胞具有良好的生物相容性，可以提供神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的三維環(huán)境，作為細(xì)胞因子控釋的載體，不僅可以保護(hù)細(xì)胞因子的生物活性，還可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞軸突生長(zhǎng)和向神經(jīng)元方向分化，多個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用，其作用更為有