Gli對(duì)食管腺癌OE19細(xì)胞生物學(xué)作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：目前對(duì)食管癌癥患者的治療多采取以手術(shù)、放化療等為主的綜合治療，但是化療藥物療效較差、毒副作用大，治療效果不甚理想。近年來(lái)隨著分子腫瘤學(xué)的快速發(fā)展，腫瘤的靶向治療越來(lái)越得到人們的重視。Hedgehog（Hh）信號(hào)通路在胚胎期調(diào)控多種細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)，對(duì)維持成熟器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及人類多種惡性腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Gli作為 Hh信號(hào)通路下游調(diào)控中心，其異常激活可以啟動(dòng)下游多種與腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。許多研究表明Gli基因通過(guò)多種機(jī)制可

2、誘導(dǎo)多種癌癥的發(fā)生，并且與多種癌癥侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來(lái)基因治療作為一種全新的治療模式顯示出良好的應(yīng)用前景，其中RNA干擾被公認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制。既往針對(duì)食管腺癌Hh通路的研究多集中在上游靶點(diǎn)Smo，針對(duì)Hh通路下游核心靶點(diǎn)Gli表達(dá)調(diào)控研究極少，所以本研究通過(guò)siRNA抑制Gli在食管腺癌OE19細(xì)胞中的表達(dá)，探討了Gli表達(dá)下調(diào)對(duì)食管腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響及可能的分子機(jī)制，旨在為臨床上食管腺癌的靶向治療提供新思

3、路。
　　方法：將不同濃度（50nmol/L和100nmol/L）Gli1、Gli2siRNA和空白對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染食管腺癌OE19細(xì)胞48h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)食管腺癌OE19細(xì)胞Gli1和Gli2mRNA表達(dá)水平；免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染OE19細(xì)胞后Gli1、Gli2、Cyclin D1、Snail和E-cadherin蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OE19細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察s

4、iRNA抑制Gli表達(dá)后對(duì)食管腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1食管腺癌OE19細(xì)胞Gli1mRNA和Gli2mRNA的表達(dá)
　　將Gli1和Gli2siRNA組檢測(cè)數(shù)據(jù)與control組（空白對(duì)照siRNA）相比較，Gli1siRNA中siRNA1mRNA和siRNA2mRNA較control組均顯著降低，三組方差分析，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.134, P=0.000）， siRNA1mRNA

5、與control比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），siRNA2mRNA與control比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）， siRNA1mRNA與siRNA2mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）；Gli2siRNA中siRNA1mRNA和siRNA2mRNA較control組均顯著降低，三組方差分析，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=262.329, P=0.000），siRNA1mRNA與control比較，差異有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義（P=0.000），siRNA2mRNA與control比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），siRNA1mRNA與siRNA2mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。
　　2食管腺癌OE19細(xì)胞中蛋白表達(dá)
　　Western blot結(jié)果表明：Gli1蛋白表達(dá)各組間有顯著性差異（F=1583.808，P=0.000）；Gli2蛋白表達(dá)各組間有顯著性差異（F=529.058， P=0.000）；Snai

7、l蛋白表達(dá)各組間有顯著性差異（F=1201.971，P=0.000）；E-cadherin蛋白表達(dá)各組間有顯著性差異（F=1742.273，P=0.000）CyclinD1蛋白表達(dá)各組間有顯著性差異（F=677.638，P=0.000）；
　　其中經(jīng)SiRNA1處理細(xì)胞后Gli1（P=0.000）、Gli2（P=0.000）、Snail（P=0.000）和CyclinD1（P=0.000）蛋白表達(dá)均顯著低于control組， E-

8、cadherin（P=0.000）蛋白表達(dá)高于control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與control組相比SiRNA2處理組Gli1（P=0.000）、Gli2（P=0.000）、Snail（P=0.000）和CyclinD1（P=0.000）蛋白表達(dá)均顯著降低， E-cadherin（P=0.000）蛋白表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)SiRNA2處理細(xì)胞后Gli1（P=0.000）、Gli2（P=0.000）、Snail（P=0.0

9、00）和CyclinD1（P=0.000）蛋白表達(dá)均低于SiRNA1組，E-cadherin（P=0.000）蛋白表達(dá)高于SiRNA1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　3細(xì)胞周期研究結(jié)果
　　G0/G1期 Control組細(xì)胞為（42.62±2.25）％， siRNA1組細(xì)胞為（58.68±2.43）%、SiRNA2組細(xì)胞為（67.39±3.21）%，三組比較方差分析結(jié)果(F=66.804，p=0.000)，SiRNA1組顯著高

10、于Control組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），SiRNA2組高于Control組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），SiRNA2組顯著高于SiRNA1組（P=0.000）；S期Control組細(xì)胞為（45.38±2.02）%，siRNA1組細(xì)胞為（39.51±2.72）%、SiRNA2組細(xì)胞為（28.45±2.04）%，三組比較方差分析結(jié)果(F=42.525，P=0.000)， SiRNA1組低于Control組（P

11、=0.032）， SiRNA2組低于Control組（P=0.000），SiRNA2組顯著低于SiRNA1組（P=0.000），差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G2/M期Control組細(xì)胞為（6.00±1.96）%，siRNA1組細(xì)胞為（5.81±2.01）%、SiRNA2組細(xì)胞為（5.16±2.34）%，三組比較方差分析結(jié)果(F=0.131，P=0.879)，差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　各組間比較差別有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=797.079，P=0.000）：與Control組穿膜細(xì)胞相對(duì)數(shù)表達(dá)量(1.00±0.01)比較，SiRNA1組穿膜細(xì)胞數(shù)相對(duì)表達(dá)量(0.72±0.01)明顯減少（P=0.000），SiRNA2組穿膜細(xì)胞數(shù)相對(duì)表達(dá)量(0.33±0.01)較control明顯減少（P=0.000）。SiRNA2組穿膜細(xì)胞數(shù)相對(duì)表達(dá)量(0.33±0.01)較SiRNA1(0.72±0.01)組明顯減少（P=0.000）。
　　結(jié)論：

13、
　　1 siRNA可以明顯抑制食管腺癌OE19細(xì)胞中GlimRNA的表達(dá)，并且具有劑量依賴性。
　　2 Hedgehog通路與食管腺癌生長(zhǎng)增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程存在密切關(guān)系，當(dāng)抑制Hedgehog通路時(shí)，其生長(zhǎng)增殖和EMT過(guò)程被明顯抑制。
　　3 Gli在食管腺癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中具有重要的作用， SiRNA通過(guò)下調(diào)Gli1和Gli2表達(dá)可抑制食管腺癌細(xì)胞周期分布和EMT能力，這可能與Gli調(diào)控CyclinD1