外周血造血干細(xì)胞來(lái)源微泡的生物學(xué)特性.pdf

1、造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells）是一類異質(zhì)性的、具有自我更新和多向血細(xì)胞分化潛能的成體干細(xì)胞。根據(jù)來(lái)源不同，其可分類為骨髓造血干細(xì)胞，臍血造血干細(xì)胞,胎肝造血干細(xì)胞和外周血造血干細(xì)胞。因外周血造血干細(xì)胞（PB-HSC）具有采集方法簡(jiǎn)便，短期內(nèi)可重復(fù)采集，受者輸注后造血、免疫功能重建快，且植入率高等優(yōu)點(diǎn)，在移植和細(xì)胞免疫治療方面發(fā)揮日益重要的作用。
　　微泡(MV)是細(xì)胞分泌的亞微米雙層膜結(jié)構(gòu)，包括從內(nèi)

2、涵體分泌的外泌體，以及從絕大多數(shù)細(xì)胞膜表面分泌的微粒。其含有母體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA以及microRNA等成分，通過(guò)與其它細(xì)胞融合，將其內(nèi)容物釋放到靶細(xì)胞，影響其功能，從而在不同細(xì)胞間信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。微泡可由多種細(xì)胞分泌，并廣泛分布于血漿、唾液、乳汁、汗液等各種體液中。不僅正常細(xì)胞可分泌微泡，腫瘤細(xì)胞也可以分泌微泡：在腫瘤病人的體液中可以檢測(cè)到微泡。因此在生理和病理狀態(tài)下,不同細(xì)胞分泌的微泡是一個(gè)混合的群體。微泡隨著

3、細(xì)胞的來(lái)源、數(shù)量、大小和抗原成分的變化而不同。
　　外周血造血干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)造血恢復(fù)等作用。因?yàn)槲⑴輲в心阁w細(xì)胞的信息，所以我們推斷外周干來(lái)源的微泡可能也具有同樣的功能。而且研究表明，微泡沒(méi)有或者具有很小的免疫原性，如果其具有一定的功能，可具有廣泛的臨床應(yīng)用。但是，目前對(duì)外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡研究甚少。本研究旨在對(duì)外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡進(jìn)行生物學(xué)特性探究，尤其對(duì)其免疫調(diào)節(jié)和促造血功能加以探索。
　　研究目的

4、提取并鑒定正常人外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡，并研究其生物學(xué)特性：包括探究正常人外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡的免疫調(diào)節(jié)功能及對(duì)造血集落形成的影響。
　　研究?jī)?nèi)容將正常人外周血造血干細(xì)胞提取并培養(yǎng)，從培養(yǎng)上清中提取出外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡并鑒定，研究其生物學(xué)特性：探究正常人外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞是否具有免疫調(diào)節(jié)功能？及正常人外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的微泡是否對(duì)造血集落形成有影響？
　　研究方法:
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5、1）利用密度梯度離心法分離正常人動(dòng)員后外周血造血干細(xì)胞，收集培養(yǎng)第48小時(shí)上清液，超速離心法分離提取微泡;
　?。?）通過(guò)電子顯微鏡觀察微泡形態(tài)；采用bicinchoninic acid(BCA)法標(biāo)定微泡數(shù)量；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物；
　?。?）將微泡與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PB-MNC）共培養(yǎng)12h后，通過(guò)共聚焦掃描電鏡觀察微泡與單個(gè)核細(xì)胞的作用方式；共培養(yǎng)48h后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA）法檢測(cè)上清

6、中IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ及TNF-α的分泌量；共培養(yǎng)48h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群及T細(xì)胞激活變化；共培養(yǎng)48h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同亞群細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子染色情況；
　?。?）采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基檢測(cè)微泡及微泡與單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后上清液對(duì)外周血造血干細(xì)胞集落形成的影響。
　　研究結(jié)果:通過(guò)密度梯度離心法可提取出動(dòng)員后外周血造血干細(xì)胞。利用超速離心法可成功提取出外周血造血干細(xì)

7、胞來(lái)源的微泡。透射電子顯微鏡觀察分離得到的微泡為卵圓形膜性小囊泡。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得微泡高表達(dá)其特異性標(biāo)志CD63(85.86％),并帶有其母體細(xì)胞標(biāo)志如干細(xì)胞標(biāo)志CD34(33.52%)，T細(xì)胞標(biāo)志CD3(43.98%)、CD45RA(23.54%)、CD45RO(68.3%)，NK細(xì)胞標(biāo)志CD56(32.32%)等。共聚焦掃描電鏡顯示微泡可以與外周血單個(gè)核細(xì)胞相融合并促進(jìn)其分泌IL-6,IL-8，IL-10與TNF-α細(xì)胞因子。流式細(xì)胞